疑似Amelogenin等位基因丢失的检测与分析12例

毕 洁，畅晶晶，余纯应

（1.北京明正司法鉴定中心，北京 100070；2.公安部物证鉴定中心，北京 110000）

釉原蛋白质（Amelogenin，AMEL）基因编码牙釉质蛋白，分别位于Xp22.1-Xp22.3（2872bp）和Yp11.2（3272bp）[1-4]。目前最常使用的特异性PCR引物是由英国法庭科学服务部（Forensic Science Service，FSS）设计的，这些引物可连接位于Amelogenin X内含子1内6bp丢失的侧翼，同时PCR扩增X和Y染色体可获得106 bp和112 bp的产物[5-6]，电泳结果显示女性个体为1条谱带（XX），男性个体为2条谱带（XY）。但这种检验方法有时会因Amelogenin基因的变异而出现性别误判[4，7-10]，需引起高度重视。 本研究拟对12例常染色体STR图谱中，男性个体出现1条谱带（X或Y）和女性个体为1条谱带但峰面积与相邻杂合子峰面积一致或低于相邻纯合子峰面积1/2的情形进行相关检测，以进一步明确性别。

1 材料与方法

1.1 样本的选取及检验

本中心日常亲权鉴定案件（20 723例）中8名社会性别为男性的血样（包含一对父子）和4名女性血样。所用样本提供者均知情同意。

12例血样前期均经SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统（司法鉴定科学研究院）扩增并检测STR分型。8名社会性别为男性的血样中，7名的Amelogenin基因座未检出Amelogenin Y，1名未检出Amelogenin X；4名女性血样的Amelogenin基因座中，Amelogenin X的峰面积与相邻杂合子峰面积一致或低于相邻纯合子峰面积的1/2。

上述样本均采用Goldeneye®DNA身份鉴定系统17X试剂盒［基点认知技术（北京）有限公司］进行补充检测，同时针对8例男性样本增加Yfiler®Plus PCR扩增试剂盒（美国AB公司）的检测。

所用试剂盒的扩增体系和热循环参数均按照说明书进行操作，扩增产物在3130xl基因分析仪（美国AB公司）上电泳，使用GeneMapperTMID-X软件进行基因分型。

1.2 Y染色体性别决定区及Amelogenin X检验

出现Amelogenin Y丢失的7例男性样本，经EX20试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）于第五色508bp处对Y染色体性别决定区（sex-determining region of Y，SRY）进行特异性扩增，扩增体系和热循环参数按试剂盒说明书进行，在3130xl基因分析仪上电泳，使用GeneMapperTMID-X软件进行基因分型。

对4例疑似Amelogenin X丢失的女性样本以及1例未检出Amelogenin X的男性样本进行扩增和测序。引物序列参照宫荣彬等[11]的报道［该研究使用的是PowerPlex®16试剂盒（美国Promega公司）］，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。正向引物：5′-GACCATTGTTTGCGTTAACAATGC-3′；反向引物：5′-GACAGACTGAGTCAGAGTGGC-3′。扩增体系 20μL，包括：DNA 模板 2μL，正向引物 1μL，反向引物 1μL，混合物 10 μL，去离子水 6 μL。扩增条件：94℃变性1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72℃延伸10min。经琼脂糖凝胶电泳，取电泳片段进行T载体克隆，在3730xl DNA分析仪（美国AB公司）上完成测序。

1.3 Amelogenin等位基因丢失的确定及丢失率统计

男性样本中出现Amelogenin X丢失的，经检测X-STR及Amelogenin X测序，与GenBank中Amelogenin X的序列比对确认；出现Amelogenin Y丢失的，经检测Y-STR、SRY及X-STR确认。女性样本中出现Amelogenin X峰值极低的，经检测X-STR及Amelogenin X测序，并与GenBank中Amelogenin X的序列比对确认。

20723 例亲权鉴定案件的类型包含三联体、父子（女）二联体和母子（女）二联体，无法准确统计无关个体的数量，故仅统计Amelogenin等位基因丢失案例在总体案例中的占比，作为Amelogenin等位基因丢失率，并对所得数据与文献[4]报道进行比较。

2 结 果

2.1 Amelogenin X等位基因丢失

1例男性样本经SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统检测，显示Amelogenin X丢失（图1）。经Goldeneye®DNA身份鉴定系统17X试剂盒检测，显示X-STR为单峰。Amelogenin X测序结果与GenBank中Amelogenin X的序列比对，样本在第304 bp处发生了A→G突变（图2），位于 PowerPlex®16试剂盒中Amelogenin基因座引物正向结合区3′端的第2个碱基。

图1 男性样本Amelogenin X丢失（圆圈所示）

图2 男性样本与GenBank中的序列比对

4例女性样本经SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统检测，显示Amelogenin X峰面积与相邻杂合子的单峰面积相当或低于相邻纯合子峰面积的1/2（图3）。经Goldeneye®DNA身份鉴定系统17X试剂盒检测，显示X-STR半数以上基因座为双峰。经Amelogenin X测序，确认其中3例女性样本的Amelogenin X序列均与GenBank中Amelogenin X的序列一致，1例女性样本也在第304bp处发生了A→G突变（图4）。

图3 女性样本Amelogenin X峰值偏低（圆圈所示）

图4 女性样本与GenBank中的序列比对

2.2 Amelogenin Y等位基因丢失

7例男性样本（包含1对父子）经SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统检测，显示Amelogenin Y丢失。经EX20试剂盒对SRY检测，其中5例（包含1对父子）SRY为阳性（在508 bp处见特异性峰，其中1例的图谱见图5），2例SRY为阴性。5例SRY检测阳性的案例中：4例（包含1对父子）出现Y-STR部分丢失，X-STR均检见单峰；1例未检出Y-STR分型，XSTR检见双峰。Y-STR部分丢失的案例中，3例在DYS576、DYS458、DYS456、DYS570、DYS449 基因座出现等位基因丢失，1 例在 DYS576、DYS627、DYS458、DYS570、DYS449、DYS481基因座出现等位基因丢失，且丢失基因座均位于Yp11.2区域。2例SRY检测阴性案例均未检出Y-STR分型，X-STR均检见双峰。

图5 1例男性Amelogenin Y缺失但SRY检测阳性（圆圈所示）

2.3 Amelogenin等位基因丢失率

经上述检测确认Amelogenin X丢失的有2例，确认Amelogenin Y丢失的有5例（包含1对父子），在20 723例亲权鉴定案例中占比0.029%（6/20 723，此处未计算SRY阳性但未检出Y-STR分型的1例）。与文献[4]报道的奥地利人群 0.018%（5/28 182）、澳大利亚人群0.020%（22/109 000）、中国人群0.023%（3/12915）的Amelogenin变异率接近。

3 讨 论

3.1 Amelogenin基因座等位基因丢失的机制及其对性别检验的影响

Amelogenin X等位基因定位于Xp22.1-Xp22.3区域。Amelogenin X丢失的发生机制多为引物结合区的点突变导致扩增失败[7]。突变类型包括G→A单点突变[6，12]、A→G 单点突变[11-12]、G→R（G+A）多点杂合突变[6，12]、C→G 转换[13]和 C→T 单点突变[7，14]等。本研究检见2例Amelogenin X丢失，均为引物结合区突变所致，突变位置均为Amelogenin X序列第304 bp处，突变类型均为A→G单点突变，与宫荣彬等[11]报道一致。值得注意的是，本研究检见1例女性样本Amelogenin X丢失，而其他相关报道[4，6]中未发现女性样本Amelogenin变异的情况。张彩虹等[15]对亲子鉴定中Amelogenin基因扩增X片段缺失的1例进行分析，孩子（男性）存在Amelogenin X引物结合区突变，而其母Amelogenin X的扩增峰高在多套试剂盒检测中均未达到期望值[16]，由此推断其母也存在Amelogenin X扩增片段丢失的可能。时永胜等[17]报道的1例扩增图谱异常的案例中，父亲X染色体存在Amelogenin基因的扩增丢失，而女儿的Amelogenin基因座峰高和峰面积为正常对照的一半，说明女儿出现这种图谱可能是在扩增时由于引物结合区突变或真正缺失Amelogenin基因导致。以上两篇文献均推断女性样本存在Amelogenin X等位基因引物结合区突变导致扩增片段丢失的可能，但都未行测序确认。Amelogenin X等位基因的丢失不会影响性别判定，但会改变X与Y的峰值比例，从而影响男女混合样本混合比例的判读[4]。

Amelogenin Y等位基因定位于Yp11.2区域，该区域的丢失是Amelogenin Y丢失的主要原因[7，9]。这种情况可以通过Y-STR分型和扩增SRY基因[18]来确认是否为男性[19-20]。此外，Amelogenin Y引物结合区的点突变、染色体易位、XX性反转综合征等遗传性疾病均可导致 Amelogenin Y 等位基因丢失[7，21]。 46，XX男性又称为de la Chapelle综合征，1964年由de la Chapelle等首先报道，属于性反转综合征（sex reversal syndrome，SRS）的一种，主要表现为患者染色体性别与性腺性别不相符，男性新生儿发生率为1∶30 000～1∶20000[22]。根据性别决定基因的检测结果，临床上可将46，XX男性SRS分为SRY阳性（90%）及SRY阴性（10%）两类[4，23-27]。 本研究 7例男性中，4例检出 YSTR分型，但存在5～6个基因座丢失，且丢失基因座均位于Yp11.2区域，推断其Amelogenin Y丢失应为包含Amelogenin Y在内的Yp11.2区域的Y染色体微缺失。分析伴随Amelogenin Y丢失的基因座，4例均伴有 DYS576、DYS458、DYS570、DYS449 基因座丢失，与邓继良等[9]报道一致。此外，4例也均伴有DYS456和（或）DYS458 基因座丢失，与文献[9，28-30]报道一致。3例未检出Y-STR分型的男性，X-STR均检见双峰，其中1例SRY阳性，2例SRY阴性，推断这3例男性存在男性SRS的可能，需进行染色体核型分析及性别分化相关基因检测[21，31-33]确认。Amelogenin Y的丢失可能导致男性样本检见女性分型，造成性别误判。

3.2 应对方法

由于女性有两条X染色体，仅一条X染色体上的Amelogenin发生变异时，另一条X染色体仍可指示性别，检验结果与表型不矛盾，而两条X染色体同时发生突变的概率非常低，所以女性Amelogenin X等位基因的丢失不容易被发现，对性别判定的影响也较小。对于男性个体，若发生Amelogenin Y等位基因的丢失，容易被误判为女性，而发生Amelogenin X等位基因丢失则很容易被发现，对性别判定的影响也较小。

Amelogenin X等位基因丢失的常见原因是引物结合区突变，可通过X-STR初步判断、Amelogenin X测序验证。包含Amelogenin Y在内的Yp11.2区域的Y染色体微缺失是Amelogenin丢失的主要原因，可能造成性别误判，可通过检测Y-STR或SRY来明确性别，对于SRY阴性的疑似46，XX男性SRS案例，建议其行染色体核型分析及性别分化相关基因检测以进一步确认性别。