1 株产γ-氨基丁酸植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

谭 霄，孙 擎，曾 林，赵婷婷，谭金龙，张 庆,*，向文良

（1.西华大学食品与生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，四川 成都 610039；2.西华大学古法发酵（酿造）生物技术研究所，四川 成都 610039）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是广泛存在于植物、动物和微生物中的一种非蛋白质氨基酸[1]。在哺乳动物脑组织中，GABA是一种重要的抑制性递质，具有降血压、镇静神经、利尿、改善脑机能、增进脑活力等功能[2-3]。此外，GABA还具有抗热应激和提高饲料的利用率等作用[4]。因此GABA被广泛应用到食品、医药、保健品及农业等行业[5]。目前，合成GABA主要有化学合成法、植物富集法和微生物合成法，相比而言，微生物合成法具有条件温和、安全性好、耗能低等优点[6-10]，因此，近年来微生物合成法制备GABA受到国内外广泛关注，其中对红曲霉、酿酒酵母、乳酸菌等[11]研究较为深入，特别是具有保健作用的乳酸菌用于合成GABA受到人们的青睐。

乳酸菌合成GABA是通过谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）专一性、不可逆地催化L-谷氨酸或钠盐α-脱羧而成[12]。GAD在野生乳酸菌中受到菌体自身代谢水平的控制，导致GAD的表达量不高[13]。同时，乳酸菌是兼性厌氧微生物，发酵周期较长，培养条件较难控制，而大肠杆菌（Escherichia coli）生长迅速、易于高密度发酵，易借助基因工程手段实现GABA的高效率生产[14-16]。目前，Park[17]、李杰[18]及Somasundaram[19]等分别将短杆菌、酿酒酵母、嗜热古菌的GAD转入到E. coli BL21（DE3）实现了异源表达；Mazzoli等[20]研究了短杆菌发酵产GABA转录组和蛋白质组的相互关系；李理等[21]研究植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵不同时间点GABA产量和GAD相对表达量之间的关系；齐育平等[22]对短乳杆菌GAD的基因进行了生物信息学分析。而对L. plantarum GAD进行原核表达，并对基因工程菌的GAD相对表达量和GABA产量相互关系的探讨及生物信息学的综合分析鲜有报道。

本实验以1 株从四川泡菜中筛选的产GABA的L. plantarum BC114[3]为出发菌株，通过克隆其GAD基因gad，生物信息学分析，并将gad转入E. coli BL21（DE3）进行诱导表达，同时对gad表达量、蛋白表达量和GABA产量进行评估，探究gad在转录、翻译和表达上的相互关联，为gad改造和发酵提高GABA产量提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

E. coli BL21（DE3）、E. coli JM109、pGEM-T Simple Vector 普洛麦格（北京）生物技术有限公司；L. plantarum BC114、pET-28a（＋）由本实验室保存。

限制性内切酶EcoRI和BamHI 美国Thermo公司；质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、细菌总RNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司；T4 DNA连接酶、Pfu DNA聚合酶 Promega（北京）生物技术有限公司；RT EasyTMI（For first-strand cDNA synthesis）试剂盒 福际生物技术（成都）有限公司。

1.2 仪器与设备

Biometra聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、qTOWER2 2.2荧光定量PCR德国耶拿分析仪器有限公司；2695高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配有Waters2998紫外检测器） 美国Waters公司；凝胶成像系统、DYCP-31琼脂糖水平电泳系统、垂直电泳系统美国Bio-Rad公司；BHC-1300A2冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 gad的克隆及测序

将L. plantarum BC114在MRS液体培养基过夜培养，利用细菌DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增gad基因，引物[23]见表1，下划线为EcoRI和BamHI限制性内切酶位点。PCR体系（50 μL）：40.5 μL ddH2O，5 μL 10×Buffer with MgSO4，1 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL upstream primer（20 μmol/L），1 μL downstream primer（20 μmol/L），0.5 μL Pfu DNA Polymerase，1 μL DNA template（100 ng/μL）；反应条件如下：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30 次，最后72 ℃ 10 min。

表1 克隆目的基因gad和荧光定量PCR引物Table 1 Primers used for cloning of target genes and real-time PCR

以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否正确，并进行胶回收。目的片段与pGEM-T载体通过T4 DNA连接酶，25 ℃过夜连接，热激转入E. coli JM109感受态细胞中。在含100 μg/mL氨苄青霉素（ampicillin，Amp）平板上培养过夜，挑取单克隆在含100 μg/mL Amp液体LB培养基中培养8～10 h，抽提质粒得到pGEM-T-gad，并采用酶切电泳和测序鉴定，序列测定由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成。

1.3.2 GAD的生物信息学分析

使用ExPASY的Protparam工具对gad编码的蛋白质的理化性质进行预测和分析；应用TMHMM Server v. 2.0在线工具预测基因编码蛋白的跨膜结构域，同时，利用PSIPED V3.3在线分析工具分析蛋白质的二级结构；利用MEGA 5.0软件构建蛋白的系统进化树；应用Swiss-Model在线工具进行同源建模，并用PROCHECK软件进行模型评估。

1.3.3 重组菌的构建

将克隆载体pGEM-T-gad经EcoRI和BamHI双酶切，产物进行琼脂糖核酸电泳，胶回收获得目的片段，并连接至同样经过EcoRI和BamHI双酶切的表达载体pET-28a（＋），热激转入到感受态细胞E. coli BL21（DE3）中，经菌落和酶切鉴定，获得E. coli BL21（DE3）/pET-28a-gad。

1.3.4 重组蛋白在E. coli BL21（DE3）中的诱导表达

将E. coli BL21（DE3）/pET-28a-gad转入到卡那平板上，通过菌落PCR筛选出阳性克隆子，并将其接种至含50 μg/mL卡那霉素的10 mL LB培养基中37 ℃、150 r/min活化8～10 h，以2%接种量转到含50 mg/L卡那霉素的100 mL LB培养基，37 ℃、200 r/min培养到OD600nm为0.6后加入1 mmol/L IPTG和0.05 mmol/L磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP），降温至28 ℃，180 r/min进行蛋白诱导表达，在诱导期间取2、4、6、8、10 h的发酵液于后续分析。

1.3.5 基因表达水平的测定

1.3.5.1 重组菌发酵过程中gad相对表达量的测定

取不同时间菌液，并按RNA提取试剂盒（天根）操作说明书步骤进行，并加入DNaseI酶（37 ℃，15 min；65 ℃，10 min）以去除RNA样品中残留的基因组DNA。按照试剂盒说明书（福际）进行反转录成cDNA第1链。以反转录成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。利用软件Primer 5.0对目的基因core of gad和内参基因16S rRNA设计特异性引物（表1）。

PCR体系（20 μL）：荧光混合染料10 μL、正反向引物各0.4 μL、cDNA模板0.5 μL，加无菌双蒸水至20 μL。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，循环40 次；溶解曲线分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s。

基因表达量的定量以16S rRNA为内参基因，发酵时间10 h的gad表达量为参比样本，以无菌双蒸水代替cDNA模板作为阳性对照，分析各基因Ct值（每个样品设置3次平行实验）。利用2-ΔΔCt法对GAD表达量进行相对定量（其中，Ct是扩增基因达到阈值时的循环数，ΔCt是目的基因与内参基因Ct值的差值，ΔΔCt是实验各时间点与实验结束时间点ΔCt值的差值）[24]。

1.3.5.2 重组菌发酵过程中十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

将菌液离心收集菌体，并用生理盐水进行洗涤，加入2×样品缓冲液煮沸10 min，然后13 000 r/min离心10 min，取上清液进行10%的SDS-PAGE分析。

1.3.5.3 重组菌产GABA表达能力评估

根据陈琳等[11]报道，以5 mL质量浓度为5 g/L的L-谷氨酸钠为底物，以不同发酵时间的菌体4 mg，乙酸-乙酸钠缓冲液（含2.5 mmol/L Ca2＋、3.5 mmol/L Mg2＋）调pH值为4.5，45 ℃条件下反应4 h。参照并结合Diana等[25]利用DNS-Cl衍生化的方法测定重组菌不同时间发酵液的GABA产量，HPLC分析条件：色谱柱为岛津-GL INERTSIL ODS-3（4.6 mm×150 mm，5 µm）；紫外检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相A为甲醇，流动相B为醋酸钠（pH 6.2）-甲醇-四氢呋喃（84∶25∶1，V/V）；流速1 mL/min；梯度洗脱时，流动相B比例：0～6 min，维持80%；6～20 min，80%～20%；20～27 min，20%～0%；27～30 min，返回80%。

2 结果与分析

2.1 L. plantarum BC114中gad的克隆

图1 重组质粒pGEM-T-gad的酶切结果Fig. 1 Identification of recombinant vector pGEM-T-gad by restriction enzyme digestion

以L. plantarum BC114基因组DNA为模板，经PCR扩增得到目的片段，胶回收该片段与pGEM-T Simple Vector连接，并转入E.coli JM109，筛选阳性克隆子，重组质粒酶切结果见图1。由EcoRI酶切结果可知，酶切后得到2 条明显分离的条带，其中1 条在大约3 000 bp处，另1 条在大约1 400 bp处，片段大小与李杰[18]报道的一致，表明该菌株可能有gad的存在，随后测序并对序列进行分析。

2.2 L. plantarum BC114中GAD的生物信息学分析

通过ExPASY的protparam在线工具结果表明：L. plantarum GAD蛋白由469 个氨基酸编码而成（GenBank登录号MF418590），其中带正电荷氨基酸残基（Arg＋Lys）共40 个，带负电荷的氨基酸残基（Asp＋Glu）总数为60 个，蛋白质理论分子等电点为5.58，分子式为C2412H3652N648O693S2，脂溶性指数为84.65。GAD蛋白在溶液中不稳定指数为30.53（＜40），说明该蛋白在溶液中性质稳定。克隆的GAD所编码的蛋白的二级结构由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲构成，分别占32.2%、11.5%、56.3%。同时，采用TMHMM Server v. 2.0预测显示，GAD蛋白中无跨膜结构域，为非跨膜蛋白。

图2 GAD氨基酸序列系统发育树Fig. 2 Phylogenetic analysis of amino acid sequence of GAD

Grone等[26]分析了脊椎动物中3 种GAD的差异，并用氨基酸序列构建系统发育树分析亲缘关系，表明GAD3与GAD1和GAD2具有同源性，但是对于L. plantarum的GAD的亲缘关系鲜见报道。本研究基于GAD氨基酸序列，采用邻位相接法（Neighbor-Joining）对其进行系统发育树的构建，结果见图2。L. plantarum BC114的GAD聚类在同一类群，同时，短乳杆菌的GAD也聚为一类，而其他Enterococcus gallinarum和Lactococcus lactis不同属的聚为一类，Lactobacillus spicheri和Lactobacillus senmaizukei不同种也聚为一类。因此，GAD在细菌中既有物种之内的保守性，又有物种之间相对变异性，较真实地反映了不同物种间的自然演化过程[19]。

图3 GAD的三级结构（A）和拉氏构象图（B）Fig. 3 Predicted tertiary structure (A) and Ramachandran plot (B) of GAD

采用Swiss-Model在线预测工具进行同源建模构建未知蛋白质三维结构，对于序列相似性大于30%的蛋白序列能够建立准确性较高的模型。对L. plantarum BC114的GAD进行同源建模，选择与PDB数据库中GAD蛋白同源最高的蛋白E. coli gad（3fz6.1），相似度45.50%，模拟GAD蛋白的三级结构，结果如图3A所示，GAD的折叠方式符合二级结构的分析结果。

采用PROCHECK工具对预测结果进行评估，结果见图3B。拉氏图中的每个区域的颜色由深到浅排列的次序依次为最佳合理区、额外合理区、一般合理区以及不合理区。结果显示，有85.9%处于最佳合理区，说明这些氨基酸残基之间不存在重叠和不合理接触，而额外合理区、一般不合理和不合理区分别占11.4%、2.2%、0.5%，此评估结果与郁凯[27]报道的大体一致。

2.3 重组表达载体pET-28a-gad的构建

随机挑取平板上菌落进行PCR，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析在约1 400 bp出现条带，与预期的条带大小一致，结果见图4A，挑取该菌落培养并抽提质粒，进行EcoRI和BamHI双酶切，酶切结果见图4B。在5 000 bp处为pET-28a（＋）质粒（5 369 bp），1 400 bp左右为gad片段。表明目的基因已成功连接到载体上，随后的测序结果准确无误，可用于后续的异源表达。

图4 菌落PCR（A）和重组质粒pET-28a-gad的双酶切验证（B）Fig. 4 PCR analysis of positive monoclonal colonies (A) identification of recombinant vector pET-28a-gad by double restriction enzyme digestion (B)

2.4 gad表达水平的测定

2.4.1 重组菌gad相对表达量的测定结果

图5 不同发酵时间点gad相对表达量Fig. 5 Relative expression levels of gad at different fermentation times

实时荧光定量PCR应用荧光信号的强弱与扩增物的量呈正比来实现定量，已广泛应用于基因突变检测、微生物学检测、基因表达的研究等领域[28-29]。图5结果表明，在不同发酵时间均检测到gad的mRNA，表明转入的gad在转录水平上已表达。gad表达量随着诱导时间的延长大体呈先升高后降低的趋势，与发酵相同时间点GABA产量趋势总体上一致（图5和图8）。发酵2～4 h，GABA产量已有显著增加，而此时的GAD基因gad相对表达量变化并不显著；6 h相对表达量达到最高值，为10 h的4.23倍；8 h相对表达量较6 h有所降低，而GABA产量有所推迟并在8 h达到最大值。本实验与基因表达相比，相关产物的合成具有一定的滞后性，但又不是单纯的滞后关系，Mazzoli等[20]报道GABA产量在基因或者转录水平上与GAD编码基因的关系不是非常紧密，可能受到其他基因的调控。

2.4.2 重组菌GAD表达蛋白SDS-PAGE分析

图6 pET-28a-gad表 达蛋白SDS-PAGE图Fig. 6 SDS-PAGE analysis of expressed product from pET-28a-gad

将重组的pET-28a-gad转入表达型E. coli BL21（DE3）加入IPTG和PLP进行诱导表达，经过垂直电泳并染色再脱色，结果见图6。与E. coli BL21（DE3）相比，重组菌均在54 kDa附近出现特异性条带，与Park等[17]报道的GAD大小一致。随着诱导时间的延长，蛋白表达量相应的增多，在诱导8 h时蛋白表达量达到最大，随后有所减低。这与田灵芝[29]的研究结果相同，即用E. coli BL21（DE3）作为宿主细胞时，宿主菌本身的蛋白酶能降解异源蛋白，在诱导末期时较为明显，因此最佳诱导表达时间为8 h。

2.4.3 重组菌产GABA表达能力评估

图7 不同发酵时间点GABA色谱图Fig. 7 Chromatograms of GABA produced at different fermentation times

利用HPLC对不同诱导发酵时间重组菌产GABA能力进行评估，其标准曲线为Y=106X-246 533（R2=0.999 9），可用于发酵液中GABA定量分析，结果见图7、8。结果表明，重组菌产GABA的最大值为2 387 mg/L，相比原始菌株L. plantarum BC114 GABA产量1 720 mg/L[3]，提高了38.7%。GABA产量随着发酵时间的延长呈现增加趋势，随后有所降低，与对应的发酵时间蛋白表达量趋势变化一致。GABA产量在2～4 h显著增加，而此刻对应的蛋白量也增加，两者都在发酵8 h达到最大值，在发酵合成GABA主要受到GAD的影响[30]，因此酶含量越高更利于将L-谷氨酸钠转化为GABA。随着发酵时间的继续延长酶含量有所降低，可能是因为E. coli BL21（DE3）本身的蛋白酶能降解异源GAD从而导致GABA含量降低。

图8 不同发酵时间点GABA产量Fig. 8 GABA accumulation levels at different time points of fermentation

3 结 论

本研究利用前期实验室筛选的L. plantarum BC114 GAD进行克隆，并对其进行生物信息学分析，GAD核酸序列长度1 410 bp，编码469 个氨基酸，等电点为5.58，蛋白的二级结构由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲构成，分别占32.2%、11.5%、56.3%，实现酶蛋白三级结构的建模预测；成功构建了基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-28a-gad，在IPTG和PLP的诱导下，该重组菌表达了一个特异性的分子质量约为54 kDa的融合蛋白。重组菌生物合成GABA量最高达到2 387 mg/L，相比L. plantarum BC114提高了38.7%。GABA代谢物的生成与gad的转录、表达不是同步进行，而是具有一定滞后性。本实验为进一步进行GAD分子改造和提高GABA产量提高提供一定的理论依据。