丙基化衍生-吹扫捕集-原子荧光光谱法同时测定动物源食品中的甲基汞和乙基汞

2018-10-08邹学权张文华

浙江化工 2018年9期

邹学权，张文华，陈孜

（浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江杭州 311215）

汞是典型的有毒元素，是全球性的重要污染物之一，在微生物的作用下，环境中的无机汞会转化成毒性更强的有机汞，有机汞主要以甲基汞和乙基汞的形态存在。在所有的汞形态中，甲基汞的毒性最强，人体血液中甲基汞的含量若超过0.2 μg/g时就会出现明显中毒症状。有机汞作为一种亲脂性高毒物，进入人体以后，主要是侵入神经系统尤其是中枢神经系统，从而对人体造成不可逆转的损害。由汞及有机汞造成的环境和食品污染问题，已经成为危害人类生存的重要公害之一。

目前测定汞形态的方法很多，最早的方法研究热点主要为气相色谱法[1-2]，常用的有苯萃取-气相色谱电子捕获法[3]、巯基棉富集气相色谱法[4]等，何滨[5]、刘毅刚[6]等采用气相色谱与原子吸收光谱法串联的办法测定农田土壤中的甲基汞和乙基汞，方法的灵敏度和精密度相对偏低，选择性差，前处理过程繁琐，操作比较困难，很难准确快速地对甲基汞和乙基汞进行检测。宋志峰[7]、王征[8]及福建省地方标准DB 35/T 895-2009[9]等采用HPLC-ICP-MS法测定环境样品中的甲基汞和乙基汞，该方法对甲基汞和乙基汞进行检测具有检出限低、重现性好、准确性高等特点，但由于该法所用仪器价格昂贵，也限制了该法的大范围普及应用。原子荧光光谱法是检测汞的常用方法，采用高效液相色谱串联原子荧光光度计法可以实现形态汞的分离与检测，针对这一检测方法的研究已有大量报道[10-13]，最早的国标中即采用原子荧光法对无机汞进行检测，最新的国标GB 5007.17-2014[14]中又加入了采用LC-AFS联用的方法检测食品中甲基汞的内容，行业标准SN/T 3034-2011[15]中实现了LC-AFS法对水产品中无机汞、甲基汞和乙基汞的同时测定，测定低限可达0.05 mg/kg。

本研究建立动物源食品中同时测定无机汞、甲基汞和乙基汞的AFS测定方法，方法灵敏度高、检测限低，检测设备简单易得、成本适中。采用丙基化衍生，通过吹扫捕集-气相色谱分离-原子荧光光谱法进行测定，由于吹扫捕集过程均在线完成，可大大提高方法的回收率与检测结果的精密度。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：盐酸，优级纯，Sigma公司；冰醋酸，优级纯，华东医药股份有限公司；氢氧化钾，分析纯，华东医药股份有限公司；甲醇，色谱纯，华东医药股份有限公司；乙酸钠，优级纯，华东医药股份有限公司；四丙基硼化钠，优级纯，华东医药股份有限公司；高纯氩气，纯度≥99.999%；高纯氮气，纯度≥99.999%。

仪器：分析天平，感量0.0001 g和0.001 g，瑞士Mettler-Toledo公司；超纯水净化系统，美国millipore公司；涡旋混匀器，太仓市科教器材厂；酸度计，瑞士Mettler-Toledo公司；Deena II样品全自动消解前处理系统；移液枪，Eppendorf。

1.2 检测装置图

本文实验中所用的检测装置见图1。

图1 检测装置图Fig 1 The diagram of detection device

1.3 标准溶液液配制

1.3.1 丙基化试剂

在200 mL的干净采样瓶中加入110 mL的超纯水和10 mL的甲醇，将称好后的2 g氢氧化钾加入瓶中溶解后放入冰箱（≤4℃）冷藏冰凉6～8 h后备用；将1 g冷冻保存的四丙基硼化钠取出，迅速加入配制好的KOH甲醇溶液，溶解定容在另一个200 mL采样瓶中用瓶塞塞紧。用移液器分别移取600 μL配制好的试剂加入到每个2 mL的离心管迅速压紧盖子，冷冻保存待用，保存期一个月。

1.3.2 缓冲溶液

称取16.2 g的优级纯醋酸钠（无水乙酸钠）加入11.8 mL优级纯冰醋酸，用超纯水定容至100 mL摇匀，待完全溶解后加入50 μL的丙基化试剂摇匀，以400 mL/min的速度用无汞氮气除汞6～8 h，盖紧瓶盖。

1.3.3 甲基汞、乙基汞溶液标准物质

甲基汞溶液标准物质（GBW 08675，76.6 μg/g）；乙基汞溶液标准物质（GBW（E）081524，75.3 μg/g），国家标准物质中心。

1.3.4 甲基汞、乙基汞标准储备液

分别移取0.6527 g甲基汞溶液标准物质与0.6640 g乙基汞溶液标准物质（见2.1.1.11），用甲醇稀释定量至50 g,此储备液中甲基汞与乙基汞的浓度均为1.0 μg/g，冰箱冷藏可保质一个月。

1.3.5 甲基汞、乙基汞标准使用液

在进样瓶中依次加 10 mL水、150 μL冰醋酸、60 μL 盐酸、300 μL 标准储备液（2.1.1.12），以水定量称重至30 g,该使用液浓度为10 ng/g；按此方法取10 ng/g使用液稀释成1 ng/g、0.01 ng/g使用液。

1.3.6 甲基汞、乙基汞标准曲线系列

取50 μL 0.01 ng/g使用液至样品瓶中，该瓶中含有的甲基汞、乙基汞含量为0.5 pg；依此方法配制 1 pg、2 pg、10 pg、50 pg、250 pg、1000 pg 的标准曲线系列。

1.4 测定

准确称取0.2 g样品，加入2 mL 25%KOH甲醇溶液，在DEENA自动消解仪上于60℃下加热4 h，间歇振动，消解完成后加去离子水8 mL定容涡旋混匀。取0.5 mL消解液于进样瓶中，加0.3 mL缓冲液，50 μL丙基化试剂，用去离子水加满进样瓶，盖紧瓶塞，上机测试。

仪器提前24 h预热，待仪器自检通过运行正常后编辑仪器方法和测定序列，测定已配制好的标准使用溶液系列、根据标准溶液的质量与响应值的对应关系得到标准曲线，再根据样品检测的响应值对样品进行定量。

2 结果与讨论

2.1 衍生剂及用量选择

在样品测试前处理进行样品衍生化反应可提高甲基汞和乙基汞的挥发性，便于吹扫捕集系统将待测物质吹扫出来，同时也便于甲基汞与乙基汞的分离。目前常用的测定有机汞的衍生试剂主要有乙基化试剂（四乙基硼化钠）、四丙基硼化钠等，由于四乙基硼化钠作为衍生剂时，乙基汞和汞离子均可能生成了乙基汞化合物，难以区分乙基汞和二价汞，因而本研究采用四丙基硼化钠作为衍生试剂。

丙基化试剂的加入属于过量反应，本研究考察了丙基化试剂用量分别为 20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、70 μL 对回收率的影响，随丙基化试剂用量的增加，回收率有增加的趋势，在用量为40 μL的时候回收率即达到峰值，过多地加入对回收率的增加影响不大,说明丙基化试剂用量在40 μL时基本可以保证反应完全,为确保高浓度的甲基汞和乙基汞能被完全衍生且节省衍生化试剂的用量,本研究采用50 μL的丙基化试剂进行衍生化反应。

2.2 标准曲线谱图及检出限

标准空白溶液及标准溶液系列点在设定的仪器条件下测定,以系列点的质量值为横坐标（X）,以峰高相应值为纵坐标（Y），仪器自动绘制出标准曲线谱图，借助软件绘制标准工作曲线。标准谱图及标准工作曲线如图2～图4所示，出峰顺序分别为元素汞（Hg0）、甲基丙基汞、乙基丙基汞、二丙基汞,各目标峰能完全分离、峰形对称，相互之间无干扰。甲基汞与乙基汞的工作曲线线性关系均良好,其中甲基汞的线性方程为：y=460.89417x+584.50187，线性相关系数为0.9999；乙基汞的线性方程为：y=172.87404+20.13597,线性相关系数为1。对标准溶液进行逐级稀释，取信噪比为3时的标液中污染物的质量浓度定义为仪器检出限，经检测，本方法甲基汞的检出限为0.0010 ng/L、乙基汞的检出限为0.0015 ng/L。

2.3 方法的精密度与回收率

图2 甲基汞与乙基汞的标准谱图Fig 2 Spectra of Methyl mercury and Ethyl mercury

图3 甲基汞的标准工作曲线Fig 3 Calibration curve for the detection of Methyl mercury

图4 乙基汞的标准工作曲线Fig 4 Calibration curve for the detection of Ethyl mercury

因汞在自然界的广泛存在，空白样品极其难找，因此在做方法精密度和加标回收实验时采用纯水作为空白样品进行加标回收实验，加标量分别为 25 pg、50 pg、100 pg，每个加标水平重复 6 次试验，以回收率为考察指标，试验结果见表1。由表1试验数据可知，使用本文建立的方法是可以得到较高的加标回收率，回收率范围为88.6%～102%，相对标准偏差RSD均小于10%，说明该法重复性好，精密度较高。

表1 回收率与精密度的试验结果

2.4 标准样品分析

采用本方法对动物源食品基质中的甲基汞与乙基汞含量进行分析，因现有的标准物质仅有鱼肉中甲基汞含量标准物质，无乙基汞的标准物质，因而乙基汞的测定采用加标的方式进行。选用国家标物中心的GBW 10029鱼肉中总汞与甲基汞成分分析标准物质，添加乙基汞的量为0.29 mg/kg，检测结果见表2。由表2数据可知，本法测定值与认定值及加标值基本吻合，与国标方法测定值基本一致。