依达拉奉对兔动脉静脉化皮瓣模型血清血管内皮生长因子、白细胞介素-1β及肿瘤坏死因子-α的影响

蒋振兴 温菊珍 程晓华 何志军 宋 渊 李 森 刘 涛

(甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)

通过静脉途径的动脉血营养使皮瓣存活，为皮瓣的选择注入新的活力，具有切取部位不受限制、皮瓣薄、切取方便，不需要牺牲主干动脉等优点，但其较低的成活率又限制其应用〔1〕。动脉化静脉皮瓣是一种非生理性皮瓣，移植后皮瓣常处于缺氧状态，目前主要以加大皮瓣血流量和提高皮瓣的抗缺血能力来提高皮瓣的成活率〔2〕。依达拉奉已成功地用于治疗各种瘀血，具有扩张血管、抗氧化、抗自由基、防止血管内皮细胞损伤等广泛的药理作用〔3,4〕。本研究拟明确依达拉奉注射液对兔动脉化静脉皮瓣组织损伤及成活面积影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1动物及药物 10月龄清洁级健康新西兰长耳白兔40只，体质量(2.5±0.5)kg，生产许可证号为SCXK(甘) 2015-0025，由兰州生物制品研究所动物实验中心提供。动物购进后安静状态下适应性饲养1 w，饮水饲料充足，光照节律12L/12D(7∶00～19∶00)，温度(23±2)℃，相对湿度(50±10)%。药物采用依达拉奉注射液(广西梧州制药集团公司，国药准字Z20025652)。

1.2试剂及仪器 HADAIA360全自动荧光磁微粒酶免分析系统/酶联免疫分析仪，兔血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-1β及肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫分析试剂盒(购自美国R.D公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3模型分组及制备 按随机数字表法分为4组，每组各10只。模型组静脉皮瓣缺血11.5 h,吻合皮瓣血管，恢复血运；对照组皮瓣缺血时间同模型组，但皮瓣缺血后，恢复血运前用甘露醇灌注皮瓣；治疗组皮瓣缺血时间同模型组，但皮瓣缺血后，恢复血运前皮瓣用灌注液为依达拉奉；空白组造兔股内侧手术切口，不做皮瓣，原位缝合，不用药。参照文献〔5〕报道的造模方法，动物以3%戊巴比妥钠(30～40 mg/kg)静脉注射麻醉，股内侧备皮，切取股内侧皮瓣，大小为7.5 cm×6.9 cm，皮瓣内包含股动静脉及周围肌组织，结扎股动静脉、隐动脉以外的血管分支，在蒂部切断股动静脉，将股动脉近端与股静脉远端缝合，结扎股动脉近端机股动脉远侧端，即形成以动脉化股静脉为供血支，隐动脉为回流支的轴型股内侧肌皮瓣，观察皮瓣血循环良好后，原位缝合。制成动脉化静脉皮瓣模型。

1.4干预方法 参考《中药药理研究方法学》〔6〕根据人兔的计量折算系数确定给药量。治疗组家兔公斤体重依达拉奉剂量50 mg·kg-1·d-1，连续7 d；对照组，造模后给予低分子右旋糖酐，按照15 ml·kg-1·d-1剂量静脉注射，连续7 d；模型组，造模后给予0.9%生理盐水，按照18 ml·kg-1·d-1剂量静脉注射，连续7 d。

1.5检测指标及方法 ①皮瓣成活率测定：术后1 w，用坐标贴纸法测量皮瓣成活面积。皮瓣成活率=皮瓣成活面积/皮瓣总面积×100%。②在术后第7天，切取皮瓣区域皮肤组织块作为标本，置入10%甲醛溶液中固定做HE染色。③血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量测定:各组分别于手术前和造模第7天后分别从心脏抽血3 ml,即刻离心，取血清4℃冰箱保存。采用酶联免疫法测定大鼠血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量，用酶标仪在450 nm波长下测量光密度(OD值)。④MDA和SOD测定:分别于术前、灌注后即刻、恢复血运1、24 h共4个时相，切取皮瓣近段区域皮肤组织块作为标本，放于-80℃冰箱或液氮罐中保存，可制成10%的组织匀浆液，随时检测MDA活性和SOD含量。

1.6统计学方法 应用统计软件SAS9.1行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1皮瓣成活率 治疗组、对照组皮瓣成活面积普遍较大，治疗组、对照组皮瓣成活情况均显著好于模型组(P<0.01)，治疗组和对照组成活情况差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2皮瓣组织切片HE染色、显微镜观察 治疗组、对照组表皮层尚完整，组织水肿，周围出现毛细血管，深层可发现血管扩张及径腔变大，管壁内有成纤维细胞增生。模型组组织水肿，表皮层有缺损，深层可见炎症细胞浸润，多有坏死及结痂组织。见图1。

2.3血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量比较 各组术前血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较，治疗组、对照组、模型组术后血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，术后治疗组及治疗组VEGF水平显著升高，而IL-1β及TNF-α含量显著降低(P<0.01)。与对照组比较，治疗组术后血清VEGF、IL-1β及TNF-α含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组皮瓣成活面积比较

与模型组比较：1)P<0.01

图1 各组术后7 d 皮瓣近端HE染色(×20)

表2 各组术前与术后血清VEGF、IL-1β、TNF-α含量比较

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05

2.4皮瓣组织MDA、SOD水平 皮瓣组织MDA含量术前4组差异无统计学意义(P>0.05)，灌注后即刻、恢复血运1、24 h，治疗组、对照组MDA显著低于模型组，SOD显著高于模型组(P<0.01)。见表3。

表3 各组皮瓣组织MDA、SOD值比较

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

3 讨 论

动脉化静脉皮瓣移植术中存在短暂的缺血期，当移植皮瓣恢复血流，就会出现不同程度的再灌注损伤。动脉化静脉皮瓣的静脉危象临床表现包括皮肤肿胀和皮瓣颜色变紫、变黑。如果不及时治疗，动脉化静脉皮瓣会发生坏死。静脉瘀血导致皮瓣病理改变，毛细血管数量减少，微血管血流减慢，血栓逐步增加〔7〕。依达拉奉是一种强效的羟自由基清除剂及抗氧化剂，具有扩张血管、减轻心肌炎心肌损伤、抑制血小板凝集、延长凝血时间、清除自由基、抗炎、抗氧化、改善血管恢复等药理作用，主要用于心脑血管疾病和中枢神经疾病的治疗，并取得良好效果〔8，9〕。本实验结果表明依达拉奉能很好地改善兔动脉静脉化皮瓣移植术后血管危象，可以减轻皮瓣组织水肿，促进血管新生，能够提高显微外科手术成功率，不良反应少，安全性好，是一种安全有效地防止血管危象的活血抗凝药。

动脉化静脉皮瓣静脉危象的各个阶段均有炎性反应和氧化应激的参与，在皮瓣愈合中起着调节与控制的重要作用。IL-1β及TNF-α等炎性因子可促进中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞及淋巴细胞等炎性细胞趋化、黏附、聚集、激活及脱颗粒，释放溶酶体酶、蛋白水解酶和脂类介质等炎性介质，从而产生对血管新生的损伤〔10〕。VEGF是肝素结合活性同源二聚体多肽，通过与血管内皮上flt和flk/Kdr两个特殊受体结合，直接刺激血管内皮增殖，内皮细胞有丝分裂增强，使血管内大量生成内皮细胞，促进血管形成。IL-1在机体感染、损伤、炎症及免疫反应等过程中起关键作用，存在形式有IL-1α和IL-1β，通过IL-1受体发挥广泛的生物学效应〔11〕。IL-1β是一种多效性的细胞因子，是脑缺血再灌注中触发炎症反应的重要介质之一，主要由血管内皮细胞、胶质细胞、神经元等活化表达〔12〕。TNF-α属于促炎因子，是炎症反应中出现最早、最重要的炎性递质之一，在免疫激活系统中起重要作用，与其受体TNFR(TNFR-α1、TNFR-α2)结合后，通过激活核转录因子(NF)-κB、Jun氨基末端激酶(JNK)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，调节细胞炎性反应，并促进其他致炎细胞因子的合成〔13〕。本研究提示炎性因子及VEGF因子参与了动脉化皮瓣静脉危象的发生发展，依达拉奉可通过干预皮瓣静脉危象炎性因子及VEGF因子的表达，而起到治疗作用。

MDA是氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物,对MDA 的检测可反映机体内脂质过氧化和机体细胞受自由基攻击的损伤程度〔14〕。SOD是体内重要的抗氧化酶，当体内自由基生成增多时，它与超氧阴离子反应生成过氧化氢，再由过氧化氢酶和谷胱甘肽酶转变成水，从而使自由基清除，保护细胞免受损伤。当皮瓣缺血再灌注时，自由基生成会逐渐增加，导致MDA含量增加，同时自由基也可以破坏SOD，引起SOD失去活力，失活SOD不能有效地清除自由基，使MDA含量进一步升高形成了一种恶性循环，本实验说明SOD和MDA之间呈现负相关的生物学特性。依达拉奉可通过抑制体内脂质过氧化和减少氧自由基对移植皮瓣的损伤，并通过促使提高SOD活性，清除自由基，促进皮瓣新生血管生成，扩张皮瓣血管，增加血流量。

综上,依达拉奉注射液能减轻脂质过氧化反应及提高机体抗氧化能力,并减轻促炎性细胞因子水平，减少皮瓣嗜中性粒细胞浸润，减轻皮瓣再灌注损伤。