CDK16在食管癌病程组织芯片中的表达及意义

郑 皓，景嘉楠，李铁鹏，董 慧，陈 卓，董子明

食管癌(esophageal cancer, EC)主要有食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)，二者的病因学和病理学特征有很大的不同。西方国家的食管癌多以腺癌常见，而我国的食管癌则是以鳞癌为主[1-3]。我国是世界上食管癌高发的国家之一，每年食管癌新发病例超过22万例，死亡超20万例[4-5]。

细胞周期紊乱与癌症的发生发展密切相关。细胞周期由细胞周期蛋白(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases, CDKs)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor,CDKI)三者共同调节[6-8]。其中CDKs受Cyclins的正调控以及CDKI的负调控，CDKs的异常表达会引起细胞周期的紊乱，从而引起肿瘤发生[9-12]。

CDKs家族成员CDK7与CDK14不仅与食管鳞癌的发生发展有密切的关系，而且可以作为食管鳞癌的预后标志物以及化疗反应的预测标志物[13-14]。研究表明，CDK16在多种肿瘤中高表达，并通过调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移以及凋亡，从而在肿瘤发生发展的过程中发挥着重要作用[15-18]。

本研究利用组织芯片研究CDK16在正常食管黏膜、食管癌原发灶、食管癌转移灶、阴性/阳性淋巴结以及32例食管鳞癌组织样本中的表达，并探讨CDK16在人食管癌组织中表达的意义，以推测CDK16在食管鳞癌发生发展中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1芯片组织芯片技术是指研究者将几十个或更多病患的组织点排列且固定在1张切片上，同时研究某一种蛋白在这些样本中的表达。实验条件一致且一次完成，可以较大地提高实验结果的可靠性[19-20]。本研究中所使用的2张食管癌组织芯片均是通过收集郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)手术切除的组织标本制作而成。实验共收集2016年3月至7月河南省肿瘤医院手术切除的食管癌标本58例，男性45例，女性13例，年龄(70±8.77)岁。所有患者均符合食管鳞癌的诊断标准[卫生部关于食管癌标准化诊治指南(2011版)]，临床病理资料完整且术前未接受任何放、化疗。所有患者均知情同意。手术切除后立即取食管癌组织及相应远端正常食管上皮组织在20～30 min内快速冷冻在液氮罐中，并保存于-80 ℃冰箱。

为了研究方便，将这2张组织芯片分别命名为hESCC-TMA060和hESCC-TMA030。其中，hESCC-TMA060组织芯片上共有60个组织标本点，共包括3例正常食管黏膜、1例食管原位癌、17例食管鳞状细胞癌的原发灶(癌/癌旁各1点)、9例食管鳞状细胞癌的转移灶、4例原发食管鳞状细胞癌患者的阴性淋巴结、9例原发食管鳞状细胞癌患者的阳性淋巴结。hESCC-TMA030组织芯片上共有30个组织标本点，共包括15例原发食管鳞状细胞癌，每1例包括癌组织和癌旁组织各1点。两张组织芯片上的所有组织标本点均匀排布于载玻片上，没有脱片，也没有明显的位移或扭曲。组织芯片经HE染色病理诊断证实。

1.1.2试剂兔抗人CDK16多克隆抗体购自英国Abcam公司。SP-9000免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司，包括封闭用山羊血清、生物素标记二抗和辣根酶标记链霉卵白素。EnVisionTM试剂盒和DAB显色液均购自福州迈新生物技术公司，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.2方法

1.2.1免疫组化首先，组织芯片经脱蜡水化，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min。然后在0.1%枸橼酸缓冲液(pH6.0～6.2)中微波修复20 min，山羊血清封闭15 min。4 ℃冰箱中一抗过夜。第2天芯片恢复室温后，依次加入生物素化的二抗和辣根酶标记链霉卵白素，分别于37 ℃条件下孵育30 min。然后依次进行DAB显色、苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明等步骤，最后用中性树胶封片。阳性对照：卵巢癌中CDK16的免疫组化染色；阴性对照：使用PBS代替一抗的食管鳞癌免疫组化染色。

1.2.2结果判定首先由两位经验丰富的病理学专家独立阅片，然后讨论分析，最终确定免疫组化结果。CDK16的阳性染色程度采用半定量计分方法判定结果。随机任选10个视野(×400)，每个视野中100个肿瘤细胞，根据免疫组化染色强度及染色细胞所占比例这二者的乘积来判定。其中，染色强度以多数细胞的着色深浅来判定：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；染色细胞所占比例：阳性细胞<5%为0分，阳性细胞占5%～25%为1分，阳性细胞占26%～50%为2分，阳性细胞占51%～75%为3分，阳性细胞>75%为4分。两项评分相乘即得到最终的分数：0分为阴性，>0分则为阳性，其中1～3分为弱阳性(+)，4～8分为中阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.3统计学分析应用SPSS 22.0统计分析软件包进行数据的统计分析。CDK16在食管鳞癌的癌组织及癌旁组织中表达的差异采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1组织芯片染色的有效性hESCC-TMA060组织芯片上共有60个组织标本点，经HE染色后，残缺点数为0，有效信息量为100%；经免疫组化染色后，残缺点数为2，有效信息量为96.7%，见图1。hESCC-TMA030组织芯片上共有30个组织标本点，经HE染色后，残缺点数为0，有效信息量为100%；经免疫组化(immunohistochemistry, IHC)染色后，残缺点数为0，有效信息量为100%，见图1。

hESCC-TMA060组织芯片、hESCC-TMA030组织芯片的IHC染色及HE染色结果，其中IHC使用CDK16抗体。IHC：免疫组织化学；HE：苏木精—伊红染色。图1 两张组织芯片的IHC与HE染色结果

2.2CDK16在食管鳞癌病程组织中的表达免疫组化染色结果显示，在正常食管黏膜中，CDK16未见表达，见图2A；在食管原位癌中，CDK16呈弱阳性表达，见图2B；在食管癌原发灶中CDK16阳性表达，且表达强度与肿瘤临床分期正相关，见图2C～F。

A：正常食管黏膜；B：食管原位癌；C：食管癌原发灶1期；D：食管癌原发灶2期；E：食管癌原发灶3期；F：食管癌原发灶4期(IHC，×200)。图2 CDK16在食管鳞癌病程组织中的表达

2.3CDK16在食管癌转移灶中的表达本研究中芯片所涉及的食管癌的转移灶主要包括左肺下叶、右肾、左颈部、背及腰部皮下、空肠、小肠这6种。其中在左肺下叶转移灶中，CDK16中阳性表达；在右肾转移灶中，CDK16强阳性表达；在左颈部转移灶中，CDK16则为弱阳性表达；在背及腰部皮下的转移灶中，CDK16强阳性表达；在空肠转移灶中，CDK16弱阳性表达；在小肠转移灶中，CDK16弱阳性表达，见图3。综上，CDK16在食管癌转移灶中呈阳性表达，但不同转移部位的表达强度存在差异。

A：转移到左肺下叶；B：转移到右肾；C：转移到左颈部；D：转移到背及腰部皮下；E：转移到空肠；F：转移到小肠(IHC，×200)。图3 CDK16在食管癌转移灶中的表达

2.4CDK16在食管癌患者淋巴结中的表达实验结果表明，在食管癌患者的阴性淋巴结细胞中，CDK16阴性表达，见图4A；而在阳性淋巴结细胞中，CDK16呈强阳性表达，见图4B。综上，CDK16表达与食管癌的淋巴结转移紧密相关。

A：阴性淋巴结；B：阳性淋巴结(IHC，×200)。图4 CDK16在食管癌患者淋巴结中的表达

2.5CDK16在食管鳞癌中的表达及定位

本次研究中的两张组织芯片共包括32例原发食管鳞状细胞癌，每1例包括癌组织和癌旁组织各1点。结果表明，CDK16在这32例食管鳞癌的癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为71.9%、37.5%，癌组织中CDK16的阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)，见表1。肿瘤细胞的分化程度可反映肿瘤的分级与恶性程度。在本研究中，CDK16在高分化食管鳞癌细胞中为弱阳性表达；在中分化食管鳞癌细胞中中阳性表达；而在低分化食管鳞癌细胞中则为强阳性表达，见图5。所以，CDK16在食管鳞癌中的表达与肿瘤分化程度呈负相关。

表1 CDK16在食管鳞癌中的表达(n=32)例(%)

注：皮尔逊卡方检验。

图5 CDK16在不同分化程度食管鳞癌中的表达(IHC，×200)

在正常食管黏膜中，CDK16整体为阴性表达，但可见零星几个细胞核呈阳性染色。这表明CDK16在正常食管黏膜中表达在细胞核，见图6A(红色箭头)；在食管原位癌中，CDK16弱阳性表达，且主要表达在细胞核中，见图6B；在食管鳞癌的高分化癌组织中，CDK16在细胞质和细胞核中均有表达，但细胞核中的表达强度远远大于细胞质中的表达强度，见图6C；在食管鳞癌的中分化癌组织中，CDK16在细胞质和细胞核中均有表达，且表达水平基本一致，见图6D；在食管鳞癌的低分化癌组织中，CDK16在细胞质和细胞核中均有表达，但在细胞质中的表达要远远强于在细胞核中的表达，见图6E；在阳性淋巴结中，CDK16在细胞质和细胞核中均表达，细胞核中的表达要远远的强于在细胞质中的表达，见图6F。

A：正常食管黏膜；B：食管原位癌；C：高分化癌组织；D：中分化癌组织；E：低分化癌组织；F：阳性淋巴结(IHC，×400)。图6 CDK16在食管鳞癌细胞中的定位

综上，在食管鳞癌中，CDK16在肿瘤细胞的细胞质和细胞核中均有表达，且总体表达水平随着肿瘤的恶性程度而增强。其中CDK16在细胞核中的表达阳性强度随着肿瘤的恶性程度依次递减，而在细胞质中的表达阳性强度随着肿瘤的恶性程度依次递增。

3 讨论

食管鳞癌患者预后差、死亡率高，5 a生存率只有17%～20%[21-22]。细胞周期紊乱与食管鳞癌发生发展密切相关。细胞周期蛋白依赖性激酶家族成员与食管鳞癌的发生发展有着密切的关系[23-24]。

CDK16也被称为PCTAIRE1或PCTK1，属于CDKs家族[25]。CDK16是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可在终末分化细胞中的信号转导通路中发挥作用，同时在分泌型蛋白从内质网上运输的过程中发挥作用[26-27]。研究发现，CDK16在包括乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌及髓母细胞瘤等多种肿瘤中具有较高的表达。CDK16在这些肿瘤细胞中通过相应的信号转导通路，在肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、迁移以及凋亡的过程中发挥着重要的作用[28-30]。但是CDK16在食管癌中的表达情况尚不明晰，也未见有相关的文献报道。本课题组的研究重点是人消化系统肿瘤的发病机制，尤其是食管鳞癌发病的分子机制。因此，作者讨论CDK16在食管癌中的表达及其意义。

本研究结果显示，CDK16在正常食管黏膜中阴性表达，在食管癌原发灶中阳性表达。尤其值得关注的是，CDK16在食管鳞癌的癌组织中的表达强度与食管鳞癌的分化程度负相关。这些结果提示，CDK16在食管鳞癌发生发展的过程中发挥着重要的作用。另外本研究还发现，CDK16在食管癌患者的阴性/阳性淋巴结细胞中分别呈现阴性/阳性表达，且CDK16在食管鳞癌的转移灶中也呈阳性表达。这就提示CDK16与食管鳞癌的淋巴结转移有着密切的关系。

本研究表明，CDK16与食管鳞癌的发生关系密切，其异常表达可能是食管鳞癌发生的关键因素之一。检测CDK16在食管鳞癌中的表达对食管鳞癌的临床诊断具有一定的指导作用。本课题组后续将重点研究CDK16对食管鳞癌细胞各项生物学功能的影响，并探究CDK16调控食管鳞癌发生发展的分子机制。