晚期EGFR突变型非小细胞肺癌接受埃克替尼治疗疗效和循环肿瘤细胞的关系

黄韵坚，黄诚，庄武，徐海鹏，黄章洲，徐振武，吴标，许春伟，陈刚

（1.福建医科大学附属福建省肿瘤医院胸部肿瘤内科，福建 福州 350014；2.福建医科大学附属福建省肿瘤医院病理科，福建 福州 350014）

在世界范围内，肺癌是死亡率最高的癌种，其中非小细胞肺癌占肺癌的85%[1]。早期肺癌手术治疗可以明显延长患者的生存时间。然而，由于肺癌早期症状并无特异性，大多数患者就诊时已伴有脑、骨、肾上腺、肝等远处转移，如无法进行手术，通常预后较差。术后切除的Ⅰ～ⅢA期肺癌患者5年生存率只有30%～40%[2]，总体5年生存率只有15%，大多数肺癌患者死于复发和远处转移[3]。

随着晚期非小细胞肺癌分子靶向治疗不断改善和新方法的不断运用，表皮生长因子受体（EGFR）基因是靶向治疗中研究最多的，EGFR-TKIs在肿瘤中对靶向EGFR基因靶点至关重要，目前EGFR-TKIs已一线用于EGFR基因突变型晚期非小细胞肺癌的治疗，但是由于耐药性的存在限制了这些药物的使用。目前，肿瘤的检测以及治疗的监测依靠于影像学和血清标志物的检查。但是影像学揭示肿瘤大小依然不能与恶性程度以及侵袭和转移能力相适应[3]。目前缺乏一个监测EGFR-TKIs疗效的高度敏感性和高度特异性的标志物能够自动评估EGFR-TKIs疗效和实时监测肿瘤复发与转移。因此，我们需要一种方法可以动态地评估EGFR-TKIs效果，延长生存时间，避免过度或延迟治疗。目前针对EGFR基因突变的一代EGFR-TKIs有吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼，其中埃克替尼是我国第一个具有知识产权的小分子靶向抗癌新药，对晚期NSCLC的治疗效果与国外抗肿瘤靶向药物的疗效相仿，并且安全性更好[4-6]。

与肿瘤预后相关肿瘤转移认为是来自外周血的循环肿瘤细胞（CTC）[7-8]。此外，CTC的数目与肺癌密切相关[9-10]。近年来微创的方法被用来评估之前化疗的疗效和CTC数量被发现与小细胞肺癌化疗疗效相关[11]。然而EGFR-TKIs治疗领域里尚未达成CTC计数EGFR-TKIs治疗效果评估和预后方面的评估。因此，我们使用接受埃克替尼治疗的晚期非小细胞肺癌患者外周血CTC作为研究对象，探索CTC计数埃克替尼在晚期非小细胞肺癌预后效果中的评价。

1 资料与方法

1.1 临床资料 我们前瞻性入组福建省肿瘤医院2015年4月～2016年8月间诊断为晚期非小细胞肺癌患者并计CTC数目。入组标准：①年龄≥18岁，≤80岁，预期寿命≥12周；②WHO体力状态评分（PS）0～2级；③未接受治疗的ⅢB～Ⅳ期新发肿瘤患者或复发转移患者；④EGFR基因检测突变型；⑤能够依从研究要求和随访程序，签署知情同意书。排除标准：①重要的血管疾病或任何严重心脏病患者；②不愿签署知情同意书的患者；③不愿接受随访的患者。本研究中74例患者组织采用ARMS法检测EGFR基因检测发现第19外显子缺失和第21外显子L858R突变。

1.2 患者治疗 患者采用埃克替尼（浙江贝达药业有限公司，规格：125 mg，批号：15051923），口服每次125 mg，每天3次，治疗持续至少1个月，最长治疗29个月，平均治疗8个月。随访至2017年9月，74例患者中53例患者达到中位总生存时间，21例密切随访中。

1.3 样本收集和CTC检测 收集患者治疗前和治疗后1个月外周血样本，每次采血5 ml。本研究采用广州益善公司开发的CanPatrolTM方法检测并计数CTC数量，具体步骤如图1。

图1 CanPatrolTM方法CTC检测步骤Figure 1 CanPatrolTM method CTC detection steps

1.4 CTC判定标准 本研究采用多重RNA探针，分别针对多种CTC特异性基因，通过不同颜色荧光信号将CTC分型：细胞内CD45（-）、EpCAM（+）和CK8/18/19（+）时，显微镜下可见红色荧光信号，为上皮型CTC；细胞内CD45（-）、Vimentin（+）和Twist（+），显微镜下可见绿色荧光信号，为间质性CTC；细胞内同时显示红色荧光及绿色荧光信号的则为混合型CTC，见图2。

图2 荧光显微镜下CTC分型（左：上皮型；中：间质型；右：混合型）Figure 2 CTC type under fluorescence microscope(left:epithelial type;middle:interstitial type;right:mixed type)

1.5 统计学方法 CTC与非小细胞肺癌患者临床病理参数之间的关系采用t检验。统计学处理无进展生存期（progression-free survival，PFS）用Kaplan-Meier法进行分析，使用Log-rank法进行单因素预后分析，PFS指从埃克替尼治疗至第一次发生疾病进展或任何原因死亡的时间。所有统计使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料进行t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC数目与临床特征的关系 患者特征如表1。其中男47例，女27例，平均年龄（60.4±6.9）岁，组织学类型腺癌65例，鳞癌4例，其他类型5例，根据TNM分期，其中ⅢB期6例，Ⅳ期68例，PS评分0～1分49例，≥2分25例。CTC数量与性别、年龄、吸烟史、组织学类型和临床分期比较差异均无统计学意义，见表1。

表1 晚期非小细胞肺癌中CTC数据与临床特征的关系Table 1 The relationship between CTC data and clinical features in advanced non-small cell lung cancer

2.2 CTC数量与埃克替尼治疗安全性 CTC数量见表3。本研究中患者CTC数量在0～187，基于我们的实验数据，我们所有患者CTC中位数量在13并作为分界点，分为低数量组和高数量组。CTC低数量组ORR为46.88%，DCR%为78.13%；CTC高数量组ORR为23.81%，DCR为38.10%，见表2。

表2 CTC数量与埃克替尼疗效的关系Table 2 The relationship between the number of CTC and the efficacy of ectopic

2.3 埃克替尼治疗前后CTC数量的比较 74例患者中，45例患者有效（CR+PR+SD），且治疗前后CTC数量变化差异有统计学意义（P=0.011）。但另外29例无效患者（PD）中，治疗前后CTC数量变化无统计学意义（P=0.083），见表3。

表3 埃克替尼治疗前后CTC数量变化（±s）Table 3 The changes in CTC count before and after treatment with ectopic(±s)

表3 埃克替尼治疗前后CTC数量变化（±s）Table 3 The changes in CTC count before and after treatment with ectopic(±s)

疗效有效无效例数45 29治疗前5.4±5.6 49.3±73.7治疗后4.0±3.3 27.2±59.1 t值2.32 1.47 P值0.011 0.083

2.4 CTC数量与预后的关系 本研究中74例患者，总体中位OS为21.5个月（95%CI：18.4～24.4个月），CTC低数量组中位OS为22.0个月（95%CI：19.6～28.7个月），CTC高数量组中位OS为18.3个月（95%CI：15.3～25.4个月）。总体的中位PFS为7.6个月（95%CI：5.3～9.4个月），CTC低数量组中位PFS为11.6个月（95%CI：8.7～15.6个月），CTC高数量组中位PFS为7.2个月（95%CI：3.4～8.7个月）。埃克替尼治疗后，EGFR基因19del组ORR为41.03%，DCR为61.54%，L858R组ORR为25.71%，DCR为42.86%，见表4。

图3 晚期非小细胞肺癌总OSFigure 3 Total OS of advanced non-small cell lung cancer

图4 晚期非小细胞肺癌中CTC数量与生存的OSFigure 4 The number of CTC and OS of survival in advanced nonsmall cell lung cancer

图5 晚期非小细胞肺癌总PFSFigure 5 Total PFS of advanced non-small cell lung cancer

图6 晚期非小细胞肺癌中CTC数量与生存的PFSFigure 6 The number of CTC and PFS of survival in advanced nonsmall cell lung cancer

表4 埃克替尼对EGFR基因不同突变位点揭示不同疗效Table 4 Eecinib reveals different therapeutic effects on different mutations in EGFR gene

3 讨论

CTC首次被描述是基于其与肿瘤细胞相似[12]，在恶性增殖和发展过程中肿瘤细胞可能改变DNA或蛋白来实现上皮间质转换，以及入侵外周循环系统形成转移性CTC[13]。化疗是晚期非小细胞肺癌主要治疗方法，但通常疗效较低。研究表明CTC数量与治疗疗效无关[8]，埃克替尼可以治疗化疗一线失败的晚期非小细胞肺癌患者，在肿瘤细胞中，EGFR基因通常表现为突变或过表达[14]，而埃克替尼可以通过凋亡形式阻碍EGFR蛋白过表达[15]。由于埃克替尼治疗延长EGFR基因突变的非小细胞肺癌患者PFS和OS时间，EGFR-TKI已经作为EGFR基因突变的晚期非小细胞肺癌一线治疗。但是，埃克替尼治疗后不可避免的出现靶向治疗耐药，而EGFR基因20外显子T790M经常占主导，这种突变能够增加EGFR和ATP之间的亲和力，正因为如此，可逆的TKI无法轻易抑制EGFR磷酸化，MET基因扩增能够激活ErbB3/PI3K/AKT信号通路引起EGFR激酶抑制剂[16]。因此，知道埃克替尼有效对治疗和预后非常重要。

晚期非小细胞肺癌患者CTC的数量较少，特别是进展期的较早阶段。正因如此，我们需要建立一个准确可靠并能重复的技术方法来检测外周血中的CTC。CanPatrolTM系统是目前唯一可以同步实现CTC形态分型、细胞分型和分子分型的先进检测技术，该系统主要通过纳米过滤技术来富集CTC，而不需要依赖特异生物标志物（如EpCAM），从而可以减少非小细胞肺癌患者CTC的丢失，具有高灵敏度、高特异性、可重复性等优点[17]。本研究数据揭示埃克替尼在CTC低数量组比CTC高数量DCR明显偏高，有效组CTC数量在治疗前和治疗后差异有统计学意义（P＜0.05）。这些数据支持CTC数量可以预测治疗结果[18-19]。中位PFS值CTC低数量组比CTC高数量要明显延长，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这些数据提示埃克替尼对治疗疗效和疾病控制效果更好。这是CTC数量与晚期非小细胞肺癌接受埃克替尼治疗预后相关的有力证据。因此，CTC数量可以用于治疗决策。但本研究样本量过小，我们需要更大样本量来验证我们的结果。

CTC低数量的晚期EGFR突变型非小细胞肺癌患者使用埃克替尼可以取得更好的疗效，CTC数量及治疗前后变化情况或可作为埃克替尼疗效的预测指标。