几种肿瘤生物标志物研究方法及结果的比较

王 婷,高友鹤

(北京师范大学生命科学学院,中国北京100875)

生物标志物是指与生理或者病理生理过程相联系的可监测的变化[1],研究者们从动物模型或人的血液、尿液、器官灌流液、细胞培养液等各处寻找这种变化作为生物标志物。本文主要论述从肿瘤细胞培养基、肿瘤动物模型的器官灌流液、尿液中利用蛋白质组学技术筛选差异蛋白质作为生物标志物的优缺点,为之后的实验提供指导。

尿液作为生物标志物更为早期敏感,因为机体内环境受稳态机制的调控,在疾病早期阶段血液里所产生的各种细微变化会被迅速降解或者排除到体外,尿液作为机体的代谢废物,能够收集这些变化。尿液样本还可以无创、连续、大量收集,受试者可以连续多次取样,实现对疾病的动态监控。其次,相对于血液中白蛋白等高丰度蛋白质的抑制作用,尿蛋白质组组成更简单,背景低。对血液和尿液采取完全一样的蛋白质鉴定分析策略,尿液中可以鉴定到更多的蛋白质[2]。另外,尿液中包含丰富的生物学信息,它能反映泌尿系统及其他系统的疾病,例如：脑部疾病、心脏疾病、代谢性疾病[3,4]。据Urinary Protein Biomarker Database(2017/06/29更新)所收录的信息,有924个尿液候选蛋白质标志物被报道与159种病理生理状态相关[5]。

我们实验室一直致力于对尿液样本收集保存方法的开发,同时探究尿液是否能反映机体各个系统的疾病状态。对于尿液样本的收集保存,实验室提出将尿液中的生物成分结合到膜上后干燥真空保存的方法[6,7]。但这种方法以及所用设备,适用于收集能自主排尿的人群的尿液样本,方便由实验室、医院等样本集中场所的专业人员操作。为了适应各种人群、方便在任何地方对尿液进行便捷高效的收集和保存,实验室还提出了绒毛浆辅助收集尿液法[8]和注射器联合滤器收集尿液法[9],前者方便了婴幼儿尿液的收集,后者使居家环境收集保存尿液成为可能。

在实验室对尿液能否反映机体疾病状态的研究中,我们发现它能反映众多系统的疾病。在肾脏疾病方面：两种不同的肾小球损伤,在肾脏组织病理学改变前,二者的尿蛋白质已明显变化[10];单侧输尿管结扎的肾脏间质纤维化模型中,尿蛋白质显著变化[11];阿霉素诱导的局灶性节段性肾小球硬化模型中,尿蛋白质随疾病进展连续变化[12]。在累及其他器官的疾病中,比如：由博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型[13]、实验性自身免疫心肌炎大鼠模型[14]、细菌性脑膜炎大鼠模型[15]、胶质母细胞瘤大鼠模型[16]以及皮下种植Walker-256肿瘤大鼠模型[17],这些模型大鼠出现临床症状或者其组织病理学改变前,尿蛋白质组都已经出现明显变化。综上所述,尿液可以早期、敏感地反映机体因疾病所产生的变化。

文中提及的肿瘤细胞系有：恶性转移性黑色素瘤细胞(SH-4,一种源自转移性黑素瘤患者的胸腔积液的细胞系),人胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)细胞(GIST882),小鼠树突状细胞肉瘤(dendritic cell sarcoma,DCS)细胞。对于文献报道的黑色素瘤细胞系(SH-4)的差异蛋白质[18],我们使用DAVID[19]生物信息学在线软件分析其生物功能;人胃肠道间质瘤细胞(GIST882)分泌蛋白质的功能源自文献[20]的结果;小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞的分泌蛋白质鉴定[21]是本实验室早期研究成果,本次分析我们使用DAVID[19]生物信息学在线软件研究其生物功能。

对于大鼠肿瘤细胞肝转移模型的研究,肝脏灌洗液的差异蛋白质及功能直接来自文献[22]的研究结论;大鼠皮下肿瘤尿液蛋白质组差异蛋白质及其功能也直接来自文献[17]的结论。

1 细胞培养液

肿瘤研究中有很大一部分标志物发现于肿瘤细胞系所分泌的蛋白质。针对恶性转移性黑色素瘤细胞(SH-4)的研究结果[18],我们使用DAVID[19]生物信息学在线软件对细胞培养基中发现的差异蛋白质(详细数据源自文献[18]的Supplementary Table 5：Output of statistical analysis from paired fibroblasts(A375 and SH-4)showing differentially expressed proteins)进行功能注释,涉及的生物过程(表1)如下：硫酸角质素分解代谢过程、糖鞘脂代谢过程、内肽酶活性的负调控、负调控凋亡过程、调节细胞死亡、对糖皮质激素的反应、细胞黏附、白细胞细胞黏附、T细胞介导的细胞毒性等。这些过程中与机体抵抗肿瘤相关的途径少之又少,仅T细胞介导的细胞毒性这一途径与免疫即机体防御相关,且其中参与的蛋白质只有2种。

另一关于人胃肠道间质瘤细胞(GIST882)的研究[20]中,我们在对该细胞培养基内所鉴定到的375种蛋白质中50.3%的分泌蛋白质进行DAVID功能注解后发现,分泌蛋白质参与的生物功能有：调节细胞凋亡、细胞生长、MAP激酶活性、免疫反应、对伤害的发展和反应、有机物质、激素刺激、氧化应激、内外刺激等(详细数据源自文献[20]的Table 4：Functional clustering of all GIST882 secretory proteins found in un-stimulated samples)。同样,在这些生物过程中与机体防御相关的机制极少,仅有的与防御相关的免疫反应这一途径中,只有12种蛋白质参与其中。

在实验室早期研究中,我们使用质谱对小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞培养基进行了分析,鉴定到72种分泌蛋白质(非差异蛋白质)[21](详细数据见文献[21]的 Table 2：Secretory proteins of mouse dendritic cell sarcoma cell line were identified by SCX-RP-MS/MS)。对72个蛋白质进行DAVID功能注解,发现涉及的生物功能(表2)有：糖酵解、各种糖类分解代谢过程、细胞稳态、细胞外结构、细胞黏附、免疫反应等,其中免疫反应与机体防御机制相关,仅有6种蛋白质参与其中。

表1 使用DAVID对人恶性转移性黑色素瘤细胞(SH-4)培养液筛选的差异蛋白质进行功能注解Table1 Functional clustering of metastatic melanoma cell line(SH-4)differentially expressed proteins

从上述对细胞培养基分泌蛋白质的研究可以看出,这些分泌蛋白质或差异蛋白质极少参与机体防御机制相关的反应,而且在这些极个别的反应中仅有为数不多的蛋白质参与其中。即使这些反应与机体抵御肿瘤相关,理论上也不能作为参考,因为细胞培养是在体外发现变化的系统,细胞生长环境不同于在体内的情况,差异可能是由外界环境刺激造成。此外,由于培养条件较复杂,稍微不适则可能造成蛋白质的改变或者细胞的死亡,不能体现机体对肿瘤的防御反应。可见,从肿瘤细胞的培养液中筛选差异蛋白质作为标志物的方法,并不是很好的寻找生物标志物的方式。

2 器官灌流液

在实验室前期研究中,我们将Walker-256肿瘤细胞接种到雄性SD大鼠脾脏中使其发生肝转移,并从模型的肝脏灌流液中鉴定出86种差异蛋白质[22],其中27种属于分泌蛋白质,59种为非分泌蛋白质(详细数据见文献[22]的Additional file 2：Table S3：Lists all the differential proteins identified in perfusates)。分泌蛋白质与非分泌蛋白质分别用 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)工具[23](http：//www.ingenuity.com/,Ingenuity Systems,Redwood City,CA,USA)进行功能分析。结果发现其中有5种分泌蛋白质：甲状腺素(transthyretin,TTR)、甘露糖结合蛋白 C(mannose-binding protein C,MBL2)、纤维连接蛋白亚型1/2(isoform 1/2 of fibronectin,FN1)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和alpha-2抗血纤维蛋白溶酶(alpha-2 antiplasmin,serpinf1)参与了急性期反应这一通路(图1A)。急性期反应是一种在免疫防御中起着重要作用的肝功能。在前述灌流液中这些蛋白质大部分呈降低的趋势(详细数据见文献[22]的 Additional file 2：Table S3：Lists all the differential proteins identified in perfusates),这表明与肝脏相关的免疫功能被转移或被肿瘤恶病质状态损害。而其他59种非分泌蛋白质参与的主要是肝脏增生/过度增殖、肝炎、脂肪肝、肝脏脂肪变性和肝细胞癌(图1B),与癌症及转移相关。

表2 使用DAVID对小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞培养液的分泌蛋白质进行功能注解的结果Table2 Functional clustering of mouse dendritic cell sarcoma cell line differentially expressed proteins

但是灌流条件并不能完全模仿真实的体内条件,并可能引起因压力或缺血造成的相关损伤,从而影响灌流液中某些蛋白质的相对丰度。因此,在灌流液中被鉴定为差异表达的一些蛋白质可能是由灌流而不是由疾病引起的变化,应该通过在血浆或血清中的进一步验证来排除这种假阳性标识。上面提到参与急性期反应的蛋白质可能就是器官在灌流过程中所产生的变化。并且,由上述结果可以看出在器官灌流液中参与机体防御机制的蛋白质很少,且是否是宿主或器官因肿瘤而不是因外界干扰(灌流)所产生的变化也有待确认,因为在灌流中机体所产生抗体已被洗去。此外,在构建动物模型的基础上,还需要对器官进行灌流,操作困难,取样麻烦,样品易受到外界环境的刺激而不能真实反映宿主因肿瘤所产生的变化。基于以上分析认为,在器官灌流液中寻找生物标志物并不是很好的方式。

3 尿液蛋白质组

我们在前期研究中使用Walker-256细胞构建了大鼠皮下肿瘤模型[17],并在该模型大鼠尿液中发现了127种差异蛋白质(详细数据见文献[17]的Supporting information Table S2：Differential proteins at different tumor stages)。使用DAVID进行差异蛋白质的功能注释,发现在生物过程类别中,急性期反应和先天性免疫反应在所有时间点都是过度表达的;补体激活、内肽酶活性的负调节、衰老和炎症反应在第6、9和14 d被过度表达;而肿瘤坏死因子产生的负调控在第9 d和第14 d过度表达(图2A)。使用IPA进行典型途径富集分析,发现在肿瘤进展期间以下途径显著富集：LXR/RXR活化、急性期反应信号传导、巨噬细胞中IL-12信号传导和产生、巨噬细胞中一氧化氮和活性氧的产生、网格蛋白药物内吞信号传导和补体系统(图2D)。

以上差异蛋白质所参与的生物过程以及经典途径大多与免疫相关,且在肿瘤发展过程中一直存在,说明这些差异蛋白质可以反映宿主在肿瘤生长过程中所产生的变化,且大部分是机体防御所造成的变化。采用这种方法筛选差异蛋白质,其优点还有：取样简单,样品只反映宿主状态而不受其他条件刺激,并且可以伴随疾病进展随时取样。

图1 Walker-256肿瘤细胞大鼠肝转移模型的肝脏灌流液中差异表达蛋白质的功能分析Fig.1 Functional analysis of the differentially expressed proteins in perfusates

图2 Walker-256肿瘤细胞皮下荷瘤大鼠模型肿瘤发展过程中尿液差异蛋白质的功能分析Fig.2 Functional analysis of differential proteins during cancer development

在我们实验室其他初步结果中也发现,使用荷瘤大鼠模型尿液蛋白质组所寻找的差异蛋白质可以很好地体现宿主对肿瘤的反应,而且众多蛋白质参与其中。例如：在大鼠肿瘤细胞肺转移模型中发现的差异蛋白质参与了这些途径：急性期反应、白细胞细胞黏附、调节炎症反应、调节免疫系统过程、补体激活,经典途径、炎症反应、吞噬,识别、先天性免疫反应等过程;大鼠肿瘤细胞骨种植瘤模型的差异蛋白质参与了：急性期反应、先天性免疫反应、炎症反应、抗菌体液应答、补体激活的负调控,凝集素途径、正向调节吞噬作用、负性调节炎症反应等过程。由此可以看出,当监测到肿瘤产生的非正常状态或者外来异物时,机体会产生一系列的防御与抵抗(包括免疫),而这些反应应该可以更好地反映疾病早期机体所产生的变化,是生物标志物更为理想的来源。

4 小结与展望

综上所述,在肿瘤细胞培养基的差异蛋白质以及全蛋白质中,参与机体防御相关反应(例如免疫)的蛋白质极少,且理论上不能体现机体反应,只能反映细胞在体外培养下的情况。荷瘤大鼠器官灌流液中筛选出的差异蛋白质同样极少参与机体防御,而且很大程度上受到灌流的刺激。虽然细胞所处的环境比培养基更像生理状态,但又不同于机体本身的状态。而从荷瘤大鼠尿液中寻找的差异蛋白质则完全不同,可以看到许多与机体防御息息相关的生物过程,并且伴随着肿瘤的进展,众多蛋白质参与其中。而免疫等机体防御疾病做出的反应,会在疾病早期发生并产生变化,而这些变化正是早期标志物的理想来源,所以三者中荷瘤大鼠的尿液是生物标志物更好的来源。

从方法上来说,利用大鼠疾病模型尿液寻找生物标志物要优于利用肿瘤细胞培养液、荷瘤器官灌流液寻找生物标志物：1)肿瘤细胞培养基中筛选差异蛋白质作为标志物,不能反映细胞在机体内的状况,差异可能由环境刺激所引发,对培养条件的要求较高,稍有变化就可能造成蛋白质的改变或者细胞的死亡;2)器官灌流操作较困难,灌流时不可以使用血液,还需排除血清或血浆的污染,且灌流会对器官造成损伤并引起一些蛋白质的变化。此外,器官已取出体外,不能全面客观地反映宿主因疾病所产生的变化;3)尿液则不同,收取样本简单方便,宿主几乎没有受到外界干扰,且伴随肿瘤进展随时取样,差异蛋白质可以全面反映宿主因肿瘤所产生的变化。而且,在早期诊断中宿主对肿瘤所产生的变化(包括免疫)是至关重要的一部分,理论上早期可能正是宿主的免疫在与肿瘤作斗争的阶段,所产生的变化对早期诊断就显得很重要,是极其重要的生物标志物来源。总的来讲,我们认为从大鼠模型尿液中寻找标志物的方法是更为合适的,得到的结果也更为合理和严谨。