急性抗阻运动通过激活Notch信号通路增加Mighty基因的表达

陶昌勇

(滁州城市职业学院，安徽 滁州 239000)

肌肉生长主要依赖于肌卫星细胞增殖分化，导致肌纤维长度和周径增加.研究证实生肌过程主要由生肌决定因子家族(MRFs)、心肌细胞增强子家族(MEF2s)和肌肉生长抑制蛋白myostatin(MSTN)调控.MSTN作为转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)家族成员之一，具有此家族的典型结构特点.研究发现MSTN在骨骼肌内大量表达，可以负向调控肌肉发生[1].MSTN先与活化素受体蛋白ⅡB(ActRⅡB)结合，增加Smad2/3介导的基因转录，抑制肌肉生长[2].大量研究发现，抑制MSTN通路可以促进肌肉生长，如敲除基因MSTN或是注入MSTN抗体或抑制其与ActRⅡB结合等均可以诱导肌肉生长[3-4],而过表达MSTN则导致小鼠骨骼肌萎缩[5].MSTN通路表达异常会影响肌肉质量.

Mighty基因是Marshall等[6]在2008年通过小鼠消减抑制杂交文库筛选出的MSTN下游直接调控基因，填补了MSTN调控肌肉生成上下游基因的空缺，可以作为MSTN通路的标记因子.有研究发现急性抗阻运动可以抑制MSTN的转录[7]，但目前为止，并无急性抗阻运动对Mighty基因影响的研究.在肌卫星细胞和骨骼肌重塑的研究中发现Notch信号通路可以通过抑制TGF-β通路调节肌肉生长[8].MSTN作为TGF-β成员之一，Mighty是MSTN调控肌肉生长的关键因子，急性抗阻运动是否也是通过Notch信号通路来抑制Mighty的转录呢？为此，本研究将检测急性抗阻运动后24 h内小鼠腓肠肌Notch信号通路和Mighty基因的动态变化，探讨急性抗阻运动对Mighty的影响及其可能的调节机制.

1 材料和方法

1.1 动物及分组

健康雄性5周龄C57BL/6小鼠30只，体重 19.53±2.06 g，购于西普尔-必凯实验动物中心，常规分笼饲养，每笼6只，自由饮食饮水，温度22±2 ℃，湿度40%～60%.随机分为5组：对照组(C)、运动后即刻组(E0)、运动后6 h组(E6)、运动后12 h组(E12)、运动后24 h组(E24)，每组6只.

1.2 运动模型

运动组进行负重爬梯训练.将爬梯放置成80°的斜面，将小鼠置于爬梯底端，从轻摇爬梯促使小鼠爬梯，至其自愿连续爬梯至顶端，使小鼠熟悉爬梯.适应性训练时，小鼠尾部负重爬梯，从爬梯底端到顶端后休息1～2 min，然后将小鼠再次置于底端，促使其攀爬，每6次为一个单元，每天进行2个单元的训练，2个单元之间间隔20 min.负荷分别为小鼠自身体重的25%、50%、75%、100%，进行递增负荷的适应性训练，为期7 d.第1 d 2个单元训练均负重25%体重；第2 d第1单元负重25%体重，第2单元负重50%体重；第3 d 2个单元均负重50%体重；第4 d第1单元负重50%体重，第2单元负重75%体重.以此类推，负重直至达到100%体重(具体方案如表1所示).然后以自身体重100%负荷进行正式负重爬梯运动，方案与第7 d一致，为期1天.对照组置于爬梯上自由活动.

表1 小鼠负重爬梯运动适应性训练表/%

1.3 取材

小鼠进行1次正式负重爬梯运动后即刻、6 h、12 h、24 h，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，断头处死，取左右侧腓肠肌，标记后置于液氮中.取材完毕转移入-80 ℃冰箱，待测PCR及Western Blot.

1.4 RT-PCR检测腓肠肌内MSTN和Mighty mRNA的表达

取适量腓肠肌组织，使用Trizol法提取小鼠腓肠肌内总RNA，以20 μL逆转录反应体系，37 ℃，反转录反应15 min；98 ℃，酶失活反应5 min.得到的cDNA保存于-20 ℃.据RT-PCR试剂盒说明进行如下操作：加入10 μL SYBR green PCR Master Mix，ROX 0.4 μL，上下游引物各0.04 μL，2 μL cDNA，补充dH2O至20 μL.MSTN上游引物：5'-TAGCAGATTCAATAGTGGTC-3'；下游引物：5'-ATTGAAATTTGACTGGGAGC-3'；Mighty上游引物：5'-TGAAGCGGCCCATGGAGTTC-3'；下游引物：5'-TTGGCCTTGTCCCGTATCGC-3'；β-actin上游引物：5'-CTCTTTTCCAGCCTTCCTTCT-3'；下游引物：5'-TGGAAGGTGGACAGTGAGG-3'.按RT-PCR扩增循环参数：预变性95 ℃，1 min；以95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，45 s为一循环，进行40个循环，记录Ct值，根据2-△△Ct法计算相对表达量.

1.5 Western Blot检测腓肠肌内NICD蛋白水平

以每20 mg组织加入100～200 uL的含PMSF的Western裂解液中混匀，置于瓷珠匀浆仪中匀浆，冰上静置10 min，重复2～4次.12 000 g离心3～5 min(4 ℃)，取上清，置于-80 ℃冰箱待测.根据BCA蛋白浓度测定试剂盒步骤(碧云天)，测定蛋白的含量.采用SDS-PAGE电泳将蛋白转移至PVDF膜上.2 h封闭后加入一抗(NICD，1∶500，c-23 307，santa)，4 ℃下摇床孵育过夜.次日加入二抗(HRP，IgG，1∶1 000，碧云天)，室温摇床孵育2 h.TBST摇床洗10 min×3次，使用ECL发光显影(避光)，Alpha凝胶成像系统自动曝光，捕捉图像，Image J1.46进行灰度值分析，将NICD蛋白与内参蛋白的平均密度之比作为NICD的相对表达水平.

1.6 统计分析

使用SPSS进行统计学分析计算，数据处理使用单因素方差分析，p﹤0.05：显著性差异，p﹤0.01：极显著性差异.所有数据均用均数±标准差来表示.

2 实验结果

2.1 急性抗阻运动对小鼠腓肠肌Mighty和MSTN基因表达的影响

如图1所示，与对照组比较，运动组小鼠腓肠肌内Mighty mRNA表达在急性抗阻运动后即刻开始上升，但没有显著性差异(p>0.05)，在运动后6 h时出现了显著性差异(p<0.05)，运动后12 h Mighty mRNA达到峰值(p<0.05)，随后开始下降，但在运动后24 h也有显著性差异(p<0.05).

如图2所示，与对照组比较，运动组小鼠腓肠肌内MSTN mRNA水平在急性抗阻运动后即刻开始下降，此时并无显著性差异(p>0.05)，运动后6 h下降到最低并出现显著性差异(p<0.05)，随后开始上升，在运动后12 h也出现显著性差异(p<0.05)，但在运动后24 h无显著性差异(p>0.05).

2.2 急性抗阻运动对小鼠腓肠肌Notch信号通路的影响

与对照组比较，急性抗阻运动后即刻小鼠腓肠肌内NICD表达上调，并出现显著性差异(p<0.05)，此现象一直持续到运动后6 h(p<0.05)，在运动后12 h、24 h并无显著性差异(p>0.05)(见图3和图4).

图1 急性抗阻运动对Mighty mRNA表达的影响

图2 急性抗阻运动对MSTN mRNA表达的影响

图3 NICD Western Blot 检测图

图4 急性抗阻运动对小鼠腓肠肌NICD蛋白水平的影响

3 分析和讨论

运动训练可以引起骨骼肌肌纤维体积增大，肌肉蛋白质代谢加强等适应性变化.本实验采用了急性抗阻运动，是据Troy[9]等的训练方法略作修改而得.Troy等发现8周的负重爬梯训练促进了肌纤维生长，诱导了肌肉肥大.而本实验采用了急性负重爬梯训练，虽然一次抗阻运动可能对肌肉蛋白质代谢的作用并不明显，但是长期运动也是急性运动累积的结果.本实验检测急性抗阻运动后即刻、6 h、12 h、24 h等时间点Mighty、MSTN以及Notch信号通路的变化，探讨了急性运动后骨骼肌内各因子的动态变化，为长期运动诱导肌肉肥大提供了理论基础.

Mighty是2008年由Marshall等发现的MSTN下游直接调控基因，可以反映MSTN信号通路的转录活性，但是目前国内并无研究人员进行运动后Mighty基因变化的研究.本研究发现急性抗阻运动后Mighty mRNA开始增加，在运动后6 h时出现了显著性差异，运动后12 h达到峰值，尽管随后有所下降，但运动后24 h仍具有显著性差异.提示，急性抗阻运动可以上调小鼠腓肠肌内Mighty基因的表达.在C2C12细胞中过表达Mighty可以导致细胞周期提前退出，p21、MyoD、MyoG、MyHC等肌肉分化标记因子增强，融合指数显著上升，形成肥大的肌管[10].而在mdx小鼠(肌营养不良小鼠模型)中过表达Mighty可以增加胫骨前肌纤维横截面积.提示，外源性补充Mighty可以促进肌细胞分化导致骨骼肌肥大.本实验通过负重爬梯训练，观察到小鼠骨骼肌内Mighty表达增加，说明抗阻运动可能通过提高Mighty表达来促进肌肉肥大，但是由于本实验采用急性抗阻运动，并没有从宏观上检测骨骼肌质量的变化，今后将继续进行长期抗阻运动对Mighty表达及骨骼肌质量的影响.

本研究同样检测了急性抗阻运动后24 h内MSTN基因表达的动态变化，发现运动后即刻MSTN表达开始减少，在运动后6 h降到最低，随后开始上升，12 h仍具显著性差异，但在24 h时MSTN表达与对照组无显著性差异，提示急性抗阻运动后MSTN表达受到抑制.贺道远等[11]研究了急性跑台运动对大鼠骨骼肌MSTN mRNA表达的影响，发现急性运动后大鼠骨骼肌MSTN表达下降.张靓等[12]研究发现长期跑台运动可以抑制腓肠肌内MSTN表达，但并不能改变比目鱼肌内MSTN表达水平.但是目前国内关于急性抗阻运动对骨骼肌内MSTN表达影响的研究较少见，本实验弥补了国内该方面研究的不足.此外，Haddad等[13]研究发现抗阻运动可以显著抑制骨骼肌内MSTN的表达，与本研究所得结果一致，但是Haddad采用了电刺激促使肌肉抗阻收缩的方式作为抗阻运动模型，而本研究采用的是负重爬梯训练.在C2C12细胞内加入MSTN可以抑制Mighty启动子活性，再向培养液中添加MSTN拮抗剂后Mighty启动子活性逐渐恢复，提示MSTN在转录水平上调控Mighty基因表达.MSTN先与活化素受体蛋白ⅡB(ActRⅡB)结合，增加Smad2/3介导的基因转录，实现其功能.本研究发现急性抗阻运动后24 h内MSTN mRNA的动态变化恰好与Mighty mRNA变化相反，提示急性抗阻运动通过抑制MSTN表达来增加Mighty基因的转录.

有研究发现Notch信号通路可抑制骨骼肌细胞内的TGF-β信号通路，促进骨骼肌肥大.在衰老过程中TGF-β信号通路和Notch信号通路平衡被破坏，抑制了骨骼肌的重塑[14].诱导睾酮素水平增加不仅可以激活Notch信号通路、抑制TGF-β通路[15]，也可以激活肌卫星细胞，促进骨骼肌肥大[16].而且MSTN是TGF-β家族成员之一，提示MSTN信号通路和Notch信号通路相互作用，共同调控骨骼肌质量.本研究发现急性抗阻运动后即刻NICD蛋白表达显著上调，并持续到运动后6 h，NICD是由Notch受体和Notch配体结合后经由α分泌酶和γ分泌酶酶切产生的，是Notch信号通路的标记性蛋白，提示急性抗阻运动后即刻Notch信号通路即被激活.本研究还发现MSTN在运动后6 h表达显著性下调，Mighty基因在运动后6 h显著性上调，说明MSTN信号通路变化是在Notch信号通路被激活之后产生的.Mighty基因是MSTN通路下游直接转录因子，提示急性抗阻运动可能通过激活Notch信号通路增加了Mighty基因的转录.

4 结论

急性抗阻运动可以抑制MSTN通路表达，增加Mighty基因的转录，其分子机制可能与急性抗阻运动后Notch信号通路的激活有关.