运动对尼古丁戒断大鼠学习与记忆能力的影响及机制

2018-09-28周跃辉周成林

中国运动医学杂志 2018年3期

周跃辉周成林

1曲阜师范大学体育科学学院（山东曲阜273165）

2上海体育学院运动科学学院（上海200438）

尼古丁依赖即烟草依赖。它通过其特异性受体——烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs），像毒品一样作用于多巴胺奖赏系统，产生强烈的成瘾性，且具有明显的戒断症状[1]。戒断症状的存在，是诱发尼古丁戒断后居高不下的复吸率的重要原因，也是治疗尼古丁依赖的最大障碍[2]。

尼古丁戒断症状是指尼古丁依赖后戒断所诱发的躯体、情感和认知障碍。其中，认知障碍是尼古丁戒断的核心症状[2]。药物成瘾理论认为，反复性药物滥用会导致大脑学习与记忆能力的病理性损伤，加重药物滥用[3]。尼古丁成瘾神经网络学说也认为，从最初自主性使用尼古丁到强迫性滥用尼古丁，意味着前额叶皮层（Prefrontal Cortex，PFC）和海马（Hippocampus，HIP）相关认知功能的受损[4]。研究也指出，缓解尼古丁戒断个体的学习与记忆能力，可能是治疗尼古丁依赖[2]、预防尼古丁戒断症状[5]的有效途径。由此可见，改善尼古丁戒断个体的学习与记忆能力，则可能有效降低尼古丁依赖。然而，目前还没有相关的治疗措施或实验研究，以改善尼古丁戒断期学习记忆为作用靶点，有效降低尼古丁戒断症状，预防复吸。

越来越多的证据也表明，运动能够有效预防和治疗多种认知功能衰退患者（如阿尔茨海默症、脑中风和抑郁症等）的学习与记忆能力损伤[6]。运动也能够减轻酒精和毒品戒断大鼠的学习与记忆损伤，降低药物依赖[7-9]。Ussher等[10]研究人员在2000年至2014年期间不断更新的系统评价数据库显示，运动干预（包括急性运动和长期运动）可以有效降低尼古丁依赖性，缓解学习与记忆障碍等戒断症状。目前，很少有研究关注运动干预与尼古丁戒断个体学习与记忆之间的关系。

神经影像学研究指出，运动强度是影响大脑认知和行为反应的重要因素[11]。不同强度的运动与大脑的唤醒水平之间存在着倒“U”型的效应关系[12]。因此，本研究建立大鼠尼古丁条件位置偏好模型，观察不同强度运动干预对尼古丁戒断大鼠学习与记忆能力的影响，并探讨其可能分子机制，旨在为今后尼古丁依赖和戒断的治疗提供新的研究靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药品

4周龄雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠（n=40），购买于中国人民解放军第二军医大学动物实验中心[SCXK（沪）2008-0016]。大鼠分笼饲养，每笼5只，自由饮食，饲养笼内温度为22.0±2℃，相对湿度为50%～60%，12 h明暗交替光照，遵循大鼠日夜生物节律。所有动物的行为学测试均安排在晚上20∶00之后。对实验动物的处理，按照上海体育学院道德伦理委员会的要求和实验动物使用许可制度进行。尼古丁酒石酸盐购买于美国Sigma公司，用0.9%生理盐水（pH 7.4～7.5）将其浓度稀释为0.5 mg/ml，采用颈背部皮下注射，每千克体重注射1 ml体积液体的药物。根据文献[13]，尼古丁注射剂量为0.5 mg/kg。

1.2 实验设计

双因素混合实验设计中，组间变量为组别（安静组，大、中、小强度运动组），组内变量为不同时间点尼古丁条件位置偏好得分（前测、中测、后测），以及水迷宫训练天数（1、2、3、4天）。自变量为不同运动强度运动干预，因变量为尼古丁条件位置偏好得分、逃避潜伏期。

单因素实验设计中，自变量为不同运动强度运动干预，因变量为大鼠记忆能力、尼古丁受体α7 nAChRs蛋白表达水平。

1.3 实验方法

1.3.1 利用条件位置偏好范式（conditioned place preference，CPP）建立大鼠关联尼古丁奖赏记忆模型

CPP实验装置及软件（TWWP-2）购自于中国医学科学院药物研究所。该装置由3个箱体构成，其中两侧的箱体为条件化训练箱（A箱和B箱），大小相同但底面纹理和侧面灯光图案不同，作为动物注射尼古丁或盐水后区分箱体的依据；中间的小箱体为过渡箱，抽去其两侧挡板，大鼠可以在3个箱子内自由穿梭活动（图1）。CPP程序分为前测期、条件化训练期和测试期。其中，大鼠在注射尼古丁训练箱（伴药侧）的停留时间减去注射生理盐水训练箱（非伴药侧）的停留时间，即为CPP得分值（秒），作为判断大鼠是否形成条件化偏好的统计依据[13,14]。

图1 条件位置偏好箱

前测期：抽去箱体中间挡板，记录大鼠15 min内在各箱体内的停留时间，作为CPP得分的基础值。剔除明显偏好任何一箱大于540秒的大鼠。

条件化训练期：大鼠进行连续8个周期的生理盐水和尼古丁给药交替训练[15]。为了排除给药顺序和箱体环境差异的影响，尼古丁和生理盐水注射采用平衡对抗设计，即一半大鼠放置A箱注射尼古丁（B箱注射生理盐水），一半大鼠放置B箱给药（A箱注射生理盐水）。

测试期：抽去箱体挡板，大鼠自由穿梭箱体，观察并记录大鼠15 min内在两个条件化箱的停留时间。大鼠条件化训练后CPP得分减去前测CPP得分，作为CPP模型是否建立成功的判断依据。大鼠运动后CPP得分（后测）减去运动前（测试期）CPP得分，作为运动影响CPP的判断依据。

1.3.2 利用Morris水迷宫实验评价尼古丁戒断大鼠的学习与记忆能力

Morris水迷宫（morris water maze，MWM）实验主要测评实验动物在水迷宫中位置感和方向感相关的学习与记忆能力。MWM主要包括定位航行实验和空间探索实验两个部分。定位航行实验包括连续4天寻找平台的游泳学习，每天4次游泳学习。在每次寻找平台的学习过程中，随机把大鼠温和地从任意一个象限放入水池，间隔30 min，再从第2个象限放入，依次放入4个象限。大鼠每次游泳学习寻找隐藏平台的时间为60 s。一旦大鼠找到平台，则让其在平台上停留30 s。如果大鼠在60 s内找不到平台，则由实验人员引导其到平台，同样让大鼠在平台上停留30 s。记录大鼠的游泳距离、平均速度和寻找平台所用时间（逃避潜伏期，escape latency）；空间探索实验在定位航行实验结束24小时后进行，测试期间撤去水中隐藏的平台，让大鼠在水池中自由游泳60 s，记录大鼠的平均游泳速度、目标象限的游泳时间和距离，以及目标象限（平台所在象限）的穿梭次数。

1.3.3 实验动物分组和跑台运动干预方案

建立大鼠尼古丁CPP模型后，所有大鼠随机分为安静组（sedentary group，SED）、小强度运动组（low-intensity exercise group，LE）、中等强度运动组（moderate-intensity exercise group，ME）和大强度运动组（high-intensity exercise group，HE）。

对中等运动强度的界定采用乳酸阈测评法[16,17]。在递增运动负荷中，血乳酸浓度急剧上升的起始点，其所对应的跑台速度约为40%～60%最大摄氧量[18]，即为中等运动强度。由于前期研究指出，尼古丁戒断症状在第1周可达到峰值，能够持续2～4周[19-21]。其中认知功能在尼古丁戒断后第9天出现显著变化[22]。同时，研究指出，连续10天的转轮运动能够显著降低尼古丁的渴求度[23]。因此，为了更好地观察尼古丁戒断对认知功能的影响，以及与前人研究作比较，选择运动干预持续总时间为10天，每天单次运动时间为30 min（不包括热身和整理活动）。如图2所示，CPP训练和测试结束后，4组大鼠停止给药，在接下来10天的戒断期内，给予不同强度的运动干预。随后，进行CPP和水迷宫测试，以及蛋白表达分析。

图2 实验流程

1.3.4 动物取材及样本处理

所有动物在行为学测试结束24 h后麻醉处死，0.9%生理盐水心尖灌注（去除脑组织血液），剥离大脑，冰上操作，迅速取出前额叶皮层和海马组织，－80℃保存。

1.3.5 蛋白质免疫印迹法（Western Blotting，WB）检测脑组织α 7 nAChRs蛋白表达水平

BCA试剂盒（碧云天）检测脑组织总蛋白浓度，调整浓度为4 μg/μl。经SDS-PAGE凝胶电泳（5%浓缩胶，10%分离胶）、PVDF转膜（恒流300 Am，100 min）、5%BD脱脂牛奶封闭（室温，1 h）、α7 nAChRs一抗（兔多克隆抗体，1∶400，Abcam）4℃过夜、二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，1∶3000，Cell Signaling）室温孵育1 h后，加ECL发光液（Millipore），天能Tanon 5200 Multi全自动化学发光成像分析系统检测目的蛋白和内参GAPDH的灰度值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。重复测量方差分析评估不同实验条件下CPP偏好值的差异、大鼠连续4天寻找平台游泳时间（逃避潜伏期）和游泳速度的差异性；单因素方差分析评估不同实验条件下大鼠的平均游泳速度、在目标象限的游泳时间、穿越目标象限的次数和在目标象限的游泳距离，以及安静组和不同强度运动组之间大鼠脑组织α7 nAChRs受体的蛋白表达差异性。事后两两比较采用Bonferroni′s或Dunnett′s法检验。统计分析中将a水平设定为0.05作为显著性水平。

2 结果

2.1 不同强度运动对大鼠尼古丁CPP的影响

4（组别：SED、LE、ME、HE）×3（CPP前测、中测和运动干预后测）的重复测量方差分析结果发现，测试时间主效应显著，F（2，46）=411.351，P＜0.001，Partial η2=0.947。测试时间与组别的交互效应显著，F（6，46）=8.620，P＜0.001，Partial η2=0.529。进一步简单主效应分析结果显示，4组的前测CPP得分之间不具有统计学差异性（P＞0.05），而4组的中测CPP得分均显著高于其前测CPP得分（P＜0.001），表明建立了尼古丁诱导的CPP模型；运动干预后，虽然4组的后测CPP得分均显著高于其前测CPP得分（P＜0.001），但仅有中等强度和高强度运动组的后测CPP得分显著低于其中测CPP得分（中等强度组：P＜0.001；大强度运动组：P＜0.05），而安静组和小强度运动组的后测CPP得分与其中测CPP得分之间不具有统计学差异性（P＞0.05）；4组的中测CPP得分之间不存在统计学差异性（P＞0.05），但中等强度和大强度运动组后测的CPP得分显著低于安静组后测CPP得分（中等强度组：P=0.005＜0.01；大强度运动组：P=0.046＜0.05）。此外，中等强度运动组的后测CPP得分也显著低于小强度运动组的后测CPP得分（P＜0.05）（图3）。

图3 不同强度运动对尼古丁CPP的影响

以上结果表明，小强度运动干预后，大鼠尼古丁CPP得分没有明显变化。大强度和中等强度运动干预后，CPP得分均显著降低，具体表现在：与安静组后测CPP得分相比，大强度运动组后测CPP得分下降了约34.96%，中等强度运动组后测CPP得分下降了约46.50%；与小强度运动组后测CPP得分相比，大强度运动组后测CPP得分没有明显变化，中等强度运动组后测CPP得分下降了约40.87%；与其本身中测CPP得分相比，大强度运动组后测CPP得分下降了约25.85%，中等强度运动组后测CPP得分下降了约49.07%。这些结果提示，中等强度和大强度跑台运动都可以显著降低大鼠尼古丁CPP得分，而中等强度运动降低CPP得分的幅度更大。

2.2 不同强度运动对尼古丁戒断大鼠学习与记忆能力的影响

在定位航行实验中（图4 A,B,C），4（组别：SED、LE、ME、HE）×4（训练天数：第1天、第2天、第3天、第4天）的重复测量方差分析结果表明，测试时间主效应显著，F（3，60）=14.887，P＜0.001，Partial η2=0.427。组别主效应显著，F（3，20）=5.796，P=0.005＜0.01，Partial η2=0.465。事后两两比较发现，4组尼古丁戒断大鼠在第2天、第3天和第4天的逃避潜伏期均显著短于第1天（P＜0.05），第4天逃避潜伏期显著短于第2天（P＜0.05）（图4 B）。而且，在连续4天的定位航行实验训练过程中，仅有中等强度运动组大鼠的逃避潜伏期显著短于安静组大鼠（P＜0.01）；4组大鼠在连续4天的寻找平台训练中，平均游泳速度不具有统计学差异性（P＞0.05）（图4 C）。

在空间探索实验中（图4 A、D、E、F），单因素方差分析结果显示，4组大鼠在目标象限的游泳时间[F（3，20）=9.495，P＜0.001]、穿梭目标象限的次数[F（3，20）=3.875，P=0.025＜0.05]、在目标象限的游泳距离[F（3，20）=6.165，P=0.004＜0.01]存在统计学差异性，4组大鼠在目标象限的游泳速度不具有显著差异性[F（3，20）=1.397，P=0.273＞0.05]。采用Bonferroni法进行事后两两比较结果显示，ME和HE组大鼠在目标象限的游泳时间显著长于SED组大鼠（P＜0.01），ME和HE组大鼠在目标象限的游泳时间之间不存在统计学差异性（P＞0.05）（图4 D）；ME和HE组大鼠在目标象限的游泳距离显著长于安静组（分别P=0.005＜0.01和P=0.019＜0.05），ME和HE组大鼠在目标象限的游泳距离不存在统计学差异性（P＞0.05）（图4 E）；仅有ME组大鼠穿梭目标象限的次数显著多于SED组大鼠（P=0.041＜0.05）（图4 F）。

图4 不同强度运动对尼古丁戒断大鼠水迷宫成绩的影响

以上结果说明，随着大鼠定位航行实验训练时间的延长，其寻找平台的游泳时间逐渐缩短，而游泳速度保持不变。其中，中等强度运动组大鼠寻找平台的游泳时间显著短于安静组。在撤去平台后，中等强度和大强度运动组大鼠在目标象限中的游泳时间和距离，均显著大于安静组，但仅有中等强度运动组大鼠穿梭目标象限的次数显著多于安静组。

2.3 不同强度运动对尼古丁戒断大鼠脑组织α 7 nAChRs蛋白表达的影响

单因素方差分析结果显示，对尼古丁戒断大鼠运动干预后，其海马组织α7 nAChRs相对于内参GAPDH的蛋白表达量不存在组间差异性[F（3，23）=0.410，P=0.747＞0.05]，但前额叶皮层α7 nAChRs相对于内参GAPDH的蛋白表达量存在组间差异性[F（3，23）=8.903，P＜0.001]。Bonferroni法进行事后两两比较，结果发现，仅ME组大鼠前额叶皮层α7 nAChRs蛋白相对表达量与SED、LE组大鼠之间存在显著差异性（P＜0.01）（图5）。

以上结果表明，中等强度跑台运动能够特异性增加尼古丁戒断大鼠前额叶皮层α7 nAChRs蛋白表达水平，而对海马组织α7 nAChRs蛋白表达水平无显著影响。

图5 不同强度运动对尼古丁戒断大鼠脑组织α7 nAChRs蛋白表达水平的影响

3 讨论

3.1 中等强度和大强度运动降低尼古丁CPP

本研究采用被动跑台运动方式，通过乳酸阈间接测量了中等运动强度区间，并以此作为大鼠在戒断期运动大、中、小强度划分的依据。结果发现，10天的中等和大强度运动干预虽然没能抑制大鼠尼古丁CPP的形成，但降低了CPP得分，说明这两种强度的运动都可以有效消退大鼠尼古丁CPP的形成。然而，与大强度运动相比，中等强度运动降低尼古丁CPP得分的幅度更大（34.96%vs 46.50%），提示中等强度运动能更有效消除尼古丁的奖赏记忆。

关于不同运动强度与尼古丁奖赏之间的关系研究主要集中在人体实验中，例如，除了低强度运动（＜20%心率储备）之外，较低强度运动（20%～40%心率储备）、中等强度运动（40%～59%心率储备）和大强度运动（60%～84%心率储备）均降低了尼古丁奖赏性，但仅有中等强度运动减少了戒断症状，改善了焦虑情绪，促进积极情绪的产生，以及延长了两次吸烟之间的间隔时间[24-27]。Bailey等[28]发现，20 min的中等强度运动（65%最大心率）和剧烈运动（80%最大心率）在运动即刻和运动后10 min，均有助于降低美沙酮维持治疗者的尼古丁依赖，但仅有剧烈运动减少了阿片渴求。这说明运动降低尼古丁和毒品渴求的效果存在着强度特异性。一项关于不同强度跑台运动与可卡因依赖性关系的动物研究指出，戒断期的大强度（10 m/min，2 h/天）和中等强度（10 m/min，1 h/天）跑台运动均可有效减弱线索诱导的大鼠可卡因SA（self-administration）复吸行为（分别降低21%和26%），但大强度运动却增加了可卡因诱导的SA复吸行为[29]。从另一角度来说，美国运动医学会（ACSM）推荐中等强度运动产生的综合效益更大，更容易坚持，给机体带来的运动损伤风险也是最小的[18]。因此，中等强度跑台运动可能能够更有效降低戒断期大鼠对尼古丁的奖赏性。

3.2 中等强度运动提高尼古丁戒断大鼠的学习与记忆能力

本研究发现，大强度运动可以显著提高尼古丁戒断大鼠的记忆能力。但是，中等强度运动不仅能够改善尼古丁戒断大鼠学习能力，也能显著提高大鼠的记忆能力。这提示大强度和中等强度运动可能通过改善尼古丁戒断大鼠与药物滥用相关的学习与记忆能力，降低尼古丁依赖性。

在运动与药物依赖个体的认知关系研究中，运动能够改善产前和产后酒精暴露大鼠海马依赖的学习与记忆损伤[7,30]，缓解神经兴奋剂哌甲酯诱导的大鼠空间学习与记忆能力损伤[31]。运动对吗啡等毒品诱导的认知损伤也具有一定的改善作用[8]。然而，运动能否缓解尼古丁戒断大鼠学习与记忆能力的损伤，尤其何种强度的运动效果最佳，都不明确。仅有个别临床研究指出，运动能够降低尼古丁诱导的前额叶、海马、杏仁核、眶额叶和伏隔核等脑区的激活程度[32,33]，提示运动可能参与尼古丁戒断个体的学习与记忆能力的调控以及尼古丁奖赏过程。Motaghinejad等[34]的动物研究指出，大鼠经过15天的尼古丁注射后（6 mg/kg/day，s.c.），戒断期15天的被动跑台运动或运动联合抗焦虑抗、抑郁药物Bupropion均能显著缓解尼古丁戒断所致的学习与记忆能力损伤（MWM实验）。与Motaghinejad研究不同的是，本研究通过尼古丁CPP模型发现，运动可以有效缓解尼古丁戒断大鼠的学习与记忆损伤，并且中等强度运动的效果更好。关于不同强度运动与认知功能之间的关系，有研究指出，与大强度和小强度运动相比，中等强度跑台运动能更有效地提高啮齿类动物在水迷宫测试中的学习与记忆能力[35-37]。可能原因是：不同强度跑台运动对学习与记忆能力的影响，与海马神经发生及其相关信号分子之间存在倒“U”型曲线关系，其中大多数研究指出，中等强度运动更能促进这些信号分子通路的传递，进而提高认知水；相反，大强度运动或力竭运动往往诱发应激反应，导致中枢神经系统氧化应激加重，损害认知功能[38-41]。Inoue等[36]的研究认为，大强度跑台运动对大鼠学习与记忆能力无影响。然而，与以上研究结果不一致的是，本研究发现，大强度运动对尼古丁戒断大鼠学习能力无影响，但能够改善其记忆能力。中等强度运动可以显著改善尼古丁戒断大鼠的学习与记忆能力。产生这种差别可能是由于本研究采用的运动强度依据是乳酸阈（LT，18 m/min），中等强度定义为乳酸阈强度（100%LT），大强度定义为133%LT，小强度定义为67%LT。而Inoue等人采用的大鼠中等运动强度是75%LT（乳酸阈强度为20 m/min[42]），大强度定义为200%LT[36]。并且，本实验对象为尼古丁依赖青年SD大鼠，Inoue等人的实验动物为老年Wistar大鼠。

3.3 中等强度运动特异性上调尼古丁戒断大鼠前额叶皮层α 7 nAChRs蛋白表达

尼古丁戒断个体的认知障碍受尼古丁受体的分子调控[43]。本研究以青年雄性大鼠为研究对象（青年、雄性大鼠更易建立尼古丁CPP）[15]，选择在大鼠尼古丁CPP戒断期进行10天的小、中、大3种强度的跑台运动干预，结果发现，与安静组相比，运动组大鼠海马组织α 7受体表达水平没有发生改变，而中等强度运动组前额叶皮层α7受体水平明显上调，这说明尼古丁戒断期的中等强度运动干预在一定程度上选择性地提高了大鼠前额叶皮层α7 nAChRs的表达。这些结果提示前额叶皮层α7 nAChRs可能参与了尼古丁戒断大鼠认知能力受损过程，同时也表明戒断期的运动干预可能通过增加前额叶α7 nAChRs表达，促进大鼠学习记忆能力和情感障碍的恢复或改善过程。

关于运动与尼古丁受体表达之间的关系，目前研究报道较少。最近研究指出，10天被动跑台运动能够通过特异性上调前额叶皮层α7 nAChRs蛋白表达，增强尼古丁戒断大鼠的反应抑制能力，促进大鼠尼古丁CPP的消退[17]。因此，α7 nAChRs可能在运动减少尼古丁戒断症状中具有重要作用。关于该受体是否真正参与运动促进尼古丁依赖的戒断，仍需要进一步研究。