二氢杨梅素联合顺铂显著诱导PC3细胞中Noxa和Bim过表达*

王进峰， 舒文云， 祝宏斌， 邝乾华

(浙江衢化医院泌尿外科， 浙江 衢州 324004)

在男性群体中，前列腺癌是临床上发病率占第二位的恶性肿瘤，严重威胁男性健康和生活质量[1-2]。目前，对于早期前列腺癌，手术切除肿瘤组织是临床上最有效的治疗方法，但对于中、晚期前列腺癌患者而言，由于肿瘤细胞的扩散，患者需要进行系统性化疗以提高其生活质量和生存率[3-4]。然而，很多患者体内的肿瘤细胞对化疗药物并不敏感，因此在化疗过程中联合一些辅助治疗药物提高肿瘤细胞的化疗敏感性是改善抗肿瘤治疗的重要策略。

顺铂(cisplatin)有较强的广谱抗肿瘤作用，具有细胞毒性，是治疗前列腺癌的常规化疗药物。顺铂在肿瘤细胞中能与DNA结合，引起交叉联结，从而破坏DNA的功能，激活肿瘤细胞的凋亡途径，使其发生凋亡性死亡[5-7]。然而顺铂的副作用较大，大剂量使用具有明显的肾毒性和耳毒性，且随着顺铂的持续使用，前列腺癌细胞会逐渐形成对顺铂的耐药性[8-10]，因此采取辅助治疗手段提高前列腺癌细胞对顺铂的化疗敏感性具有十分重要的临床意义。

二氢杨梅素(dihydromyricetin)又名蛇葡萄素，是一种具有很强药理活性的黄酮类化合物，具有解除醇中毒和抑制细胞恶变的作用，文献报道二氢杨梅素还有一定的抗肿瘤活性[11-12]，然而其是否能增强顺铂的抗前列腺癌活性至今仍很少报道。本研究的目的在于探讨二氢杨梅素对前列腺癌顺铂化疗的辅助作用并研究其机制。

材 料 和 方 法

1 细胞培养

人前列腺癌细胞系PC3和LNCaP购于美国模式培养物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)，培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃恒温培养箱中培养并通入5% CO2。

2 实验试剂

顺铂、二氢杨梅素、MTT和凋亡检测试剂盒购于Sigma-Aldrich；DMEM培养基购于Gibco；蛋白提取液，以及抗FOXO1、Bim、Noxa、caspase-9、caspase-3、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor-1, Apaf-1)、细胞色素C (cytochrome C)和GAPDH抗体购于Cell Signaling Technology；线粒体分离试剂盒购于碧云天生物科技有限公司；蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠和FOXO1小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)购于Santa Cruz；ECL显色试剂盒购于Pierce；Lipofectamine 2000购于Invitrogen。

3 方法

3.1FOXO1基因沉默 将PC3细胞接种在6孔板中孵育过夜，使其贴壁。将50 nmol/LFOXO1 siRNA用Lipofectamine 2000进行包裹后将其加入到无血清培养基进行混合。吸取原6孔板中的培养基，并将上述含FOXO1 siRNA的无血清培养基加入到6孔板中。细胞孵育6 h后吸去无血清培养基，并加入新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基培养24 h。对照组细胞采用Lipofectamine 2000(含无关siRNA)孵育6 h。

3.2细胞活力的检测 将常规PC3细胞、LNCaP细胞和FOXO1基因沉默的PC3细胞按每孔5×103接种在96孔板中孵育过夜，后加入顺铂(0、1、2、5、10、15、20和30 μmol/L)和二氢杨梅素(0、5、10、50、100和200 μmol/L)处理细胞48 h，之后加入20 mL MTT(5 g/L)37 ℃恒温培养箱中培养4 h，移除孔内培养基，加入100 μL二甲亚砜，充分振荡混匀后在570 nm波长下测定吸光度(A)。细胞活力结果用药物处理组与对照组的A值比值表示。

3.3线粒体分离 转染后的PC3细胞经顺铂(2 μmol/L)和二氢杨梅素(10 μmol/L)联合处理48 h后，用线粒体分离试剂盒按说明所示步骤分离移除PC3细胞中的线粒体，收集无线粒体的细胞质用以检测其中的细胞色素C。

3.4Western blot实验 转染后的PC3细胞经顺铂(2 μmol/L)和二氢杨梅素(10 μmol/L)联合处理48 h后，用蛋白提取液提取PC3细胞中的总蛋白。在等量的总蛋白质中加入上样缓冲液后用10% SDS-PAGE进行分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭孵育2 h。加入抗FOXO1、Bim、Noxa、caspase-9、caspase-3、Apaf-1、cytochrome C和GAPDH的 I 抗对PVDF膜进行孵育过夜，后再用带辣根过氧化物酶的 II 抗孵育2 h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

3.5免疫共沉淀 转染后的PC3细胞经顺铂(2 μmol/L)和二氢杨梅素(10 μmol/L)处理48 h后，用蛋白提取液对PC3细胞进行裂解。裂解后的细胞在12 000 r/min下离心10 min，收取上清液分成等量2份，一份直接进行Western blot实验作为对照(input)，另外一份加入Apaf-1抗体孵育过夜，孵育完成后在该体系中加入蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠孵育2 h。之后在共沉淀产物中加入上样缓冲液并煮沸除去琼脂糖珠后进行Western blot实验，检测与Apaf-1结合的caspase-9蛋白。

3.6细胞凋亡实验 转染后的PC3细胞经顺铂(2 μmol/L)和二氢杨梅素(10 μmol/L)处理48 h后按说明书步骤用凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡情况，用流式细胞术进行分析，Annexin V阳性细胞即为凋亡细胞。

4 统计学处理

统计分析软件为SPSS 15.0。所有实验重复3次，实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示。组间均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，行Bonferroni校正进行多组间均数的两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 二氢杨梅素显著增强顺铂对前列腺癌细胞的杀伤活性

MTT实验结果显示，二氢杨梅素单独处理对PC3和LNCaP细胞的杀伤活性都较弱，见图1A、B，然而较低浓度的二氢杨梅素(10 μmol/L)联合处理却能显著提高不同浓度顺铂(0～30 μmol/L)对前列腺癌细胞系PC3和LNCaP的杀伤活性(P<0.05)，表明二氢杨梅素辅助治疗能明显增强前列腺癌细胞对顺铂的敏感性,见图1C、D。在对PC3的联合治疗中，二氢杨梅素(10 μmol/L)联合较低浓度顺铂(2 μmol/L)已能显著杀伤肿瘤细胞，因此选择该浓度药物进行机制研究。

Figure 1. Dihydromyricetin enhanced the cytotoxicity of cisplatin against prostate cancer cells. A: cytotoxicity of dihydromyricetin (0～200 μmol/L) against PC3 cells； B: cytotoxicity of dihydromyricetin (0～200 μmol/L) against LNCaP cells； C: dihydromyricetin (10 μmol/L) increased the cytotoxicity of different concentrations of cisplatin (0～30 μmol/L) against PC3 cells； D: dihydromyricetin (10 μmol/L) increased the cytotoxicity of different concentrations of cisplatin (0～30 μmol/L) against LNCaP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图1二氢杨梅素增强顺铂对前列腺癌细胞的杀伤活性

2 二氢杨梅素提高顺铂对PC3细胞的杀伤活性依赖于FOXO1途径

Western blot实验结果显示,二氢杨梅素能明显诱导PC3细胞中FOXO1的表达(P<0.05)，表明FOXO1是二氢杨梅素的作用靶点,见图2A。MTT实验结果显示,尽管二氢杨梅素辅助治疗能明显提高顺铂的抗前列腺癌活性，然而转染FOXO1 siRNA后，二氢杨梅素对顺铂的协同作用受到明显抑制(P<0.05)，提示二氢杨梅素通过上调前列腺癌细胞中FOXO1的表达提高其对顺铂化疗的敏感性，见图2B。另外，Western blot实验结果显示二氢杨梅素联合顺铂能显著诱导PC3细胞中促凋亡蛋白Noxa和Bim的表达，而转染FOXO1 siRNA后，两者联合诱导的Noxa和Bim的过表达受到显著抑制(P<0.05)，提示二氢杨梅素可能通过FOXO1-Noxa/Bim途径促进顺铂诱导的凋亡通路，见图2C。

Figure 2. Dihydromyricetin-promoted death of cisplatin-treated PC3 cells was dependent on the FOXO1 pathway. A: dihydromyricetin decreased the expression of FOXO1 in PC3 cells; B:FOXO1 siRNA suppressed the promotion of dihydromyricetin on cisplatin-induced death of PC3 cells; C: combination of dihydromyricetin and cisplatin induced overexpression of Noxa and Bim in PC3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vscisplatin group;#P<0.05vscisplatin+dihydromyricetin group.

图2二氢杨梅素提高顺铂对PC3细胞的杀伤活性依赖于FOXO1途径

3 二氢杨梅素联合顺铂诱导PC3细胞发生线粒体途径凋亡

鉴于二氢杨梅素联合顺铂能显著诱导PC3细胞中促凋亡蛋白Noxa和Bim的表达，本研究进一步探讨两者联合对PC3细胞凋亡通路的影响。Western blot实验结果显示，二氢杨梅素联合顺铂处理的PC3细胞的细胞质中细胞色素C蛋白水平显著升高(P<0.05)，表明二氢杨梅素联合顺铂能显著诱导PC3细胞的细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中,见图3A。免疫共沉淀实验结果显示,二氢杨梅素辅助治疗能明显促进顺铂诱导的Apaf-1和caspase-9的相互作用(P<0.05),见图3B。

在其下游凋亡信号通路中，实验结果显示二氢杨梅素联合顺铂显著诱导PC3细胞发生caspase-9和caspase-3的活化(P<0.05),见图3C,并最终导致其发生显著的凋亡(P<0.05),见图3D。这些实验结果表明二氢杨梅素能通过FOXO1-Bim/Noxa途径增强顺铂对前列腺癌细胞的凋亡诱导活性。

讨 论

二氢杨梅素是一种天然黄酮类有效成分，具有抗氧化、抗血栓和抗炎作用。近期的研究发现二氢杨梅素还具有一定的抗肿瘤活性，如二氢杨梅素能通过抑制肝癌细胞中MMP-9蛋白的表达抑制其转移和侵袭能力[13]，又如二氢杨梅素能通过ROS-STAT3信号通路促进头颈癌细胞的凋亡和自噬[14]，然而二氢杨梅素在前列腺癌细胞中的生物学活性及其对顺铂化疗的协同效应至今仍很少报道。顺铂是治疗前列腺癌的重要化疗药物，研究表明顺铂能诱导肿瘤细胞发生线粒体途径的凋亡[15]，然而顺铂的副作用较大，大剂量的使用具有明显的肾毒性和耳毒性，且一些前列腺癌细胞对顺铂治疗的敏感性较低，因此采取辅助治疗手段降低顺铂的使用剂量并提高其抗肿瘤活性十分重要。

Figure 3. Combination of dihydromyricetin and cisplatin induced mitochondrial apoptosis in PC3 cells. A: dihydromyricetin promoted release of cytochrome C in cisplatin-treated PC3 cells; B: dihydromyricetin promoted the interaction of Apaf-1 and caspase-9 in cisplatin-treated PC3 cells; C: dihydromyricetin promoted cleavage of caspase-9 and caspase-3 in cisplatin-treated PC3 cells; D: dihydromyricetin significantly enhanced the cisplatin-induced apoptosis in PC3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vscisplatin group;#P<0.05vscisplatin+dihydromyricetin group.

图3二氢杨梅素联合顺铂诱导PC3细胞发生线粒体途径凋亡

在本研究中，预实验结果发现二氢杨梅素单独治疗对前列腺癌细胞的杀伤活性较弱，较高浓度仍不能达到理想的抗肿瘤效果。然而较低浓度的二氢杨梅素(10 μmol/L)即能明显增强各种浓度顺铂的抗前列腺癌活性，使较低浓度的顺铂(2 μmol/L)也能对前列腺癌细胞产生显著的杀伤活性，表明二氢杨梅素对前列腺癌的顺铂化疗有协同效应。

FOXO1是一个很重要的转录因子，参与细胞中各种生理活动，包括DNA修复、细胞周期的转换递进和凋亡信号的传递。FOXO1已经被证实是一种肿瘤抑制性分子，肿瘤细胞中FOXO1表达的缺失将促进肿瘤的发生和恶性细胞的增殖[16-17]。此外，FOXO1还能增强一些下游促凋亡基因，如Noxa和Bim的转录活性，因此FOXO1的过表达能促进肿瘤细胞发生线粒体途径的凋亡[18-19]。本研究的机制性实验结果表明二氢杨梅素能明显提高前列腺癌细胞中FOXO1蛋白的表达水平，从而增强了前列腺癌细胞中Noxa和Bim基因的转录活性，使肿瘤细胞在顺铂的治疗下能发生Noxa和Bim的过表达，进而诱导前列腺癌细胞发生线粒体途径的凋亡，表现为细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中，并在细胞色素C的参与下，Apaf-1与caspase-9发生相互作用使之活化，再通过下游分子caspase-3的参与最终使前列腺癌细胞发生凋亡性死亡。

综上所述，本研究证明了二氢杨梅素能显著增强顺铂的抗前列腺癌活性并研究了其机制。这些研究为提高化疗药物的临床疗效并降低其使用剂量提供了新的策略和思路。