膝关节炎模型体重与病理形态相关性及针刀干预的实验研究*

张 伟,王 彤,王丽娟,周 帅,孙硕熏,马诗凝,郭长青

( 北京中医药大学，北京 100029)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是最常发生的骨骼肌肉系统疾病，亚洲人受累关节中膝关节所占比重最大，我国60岁以上人群中膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)发病率达50%，发病患者致残率高达53%[1]。随着人口老龄化加剧，膝骨关节炎的防治已成为关乎民生的公共卫生问题。膝关节作为主要负重关节 ，直立行走时，其关节面的最大轴向作用力为2.3～7.1倍体重[2-3],说明体重是造成关节软骨高负荷、引起KOA发生、发展的重要因素之一[4]。研究证实降低体重可以显著降低KOA的发生率，减轻KOA的疼痛症状[5-7]。针刀疗法是在传统中医经筋理论指导下，结合现代解剖及生物力学的治疗方法，临床对于KOA及肥胖等均疗效显著[8]。那么针刀对KOA的治疗作用是否也与其减轻体重、降低膝关节的应力负荷有关。体重与软骨的病理表现程度存在怎样的关系，是否体重越重会加剧膝关节的病理表现？目前缺乏相关的实验报道。针刀对体重造成的膝关节高应力负荷会有怎样的影响，是否减轻体重也是其发挥疗效的途径之一?为验证这一假说，本实验中KOA模型的制备方法为改良后 Videman伸直位固定法,观察造模、针刀干预前后的体重及软骨的光镜下病理表现，并分析体重与膝软骨病理改变的相关关系；探讨针刀减轻体重、降低膝关节的应力负荷是否为针刀疗效的途径之一。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6月龄清洁健康级新西兰兔40只，雄性，SPF级，体质量(2.5±3.0)kg，由北京科宇动物养殖中心提供(动物质量合格证号：DH 201601958)。单笼饲养于中国中医科学院中药研究所大动物实验室(23℃～25℃，湿度60%)，自由摄食饮水，清洁级饲料及饮用水。依照中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》进行实验动物处置，严格遵循中国中医科学院中药研究所动物实验福利伦理审查要求(动物实验福利伦理审查编号：AN-1001-20173001)。

1.2 试剂及仪器

树脂树脂绷带(5#：150 mm×1 800 mm，衡水康洁医疗器械有限公司)，可耐特高分子绷带(KNT03：50 mm×3 600 mm，苏州可耐特医疗科技有限公司)，汉章针刀(超微：0.4 mm×30 mm，北京卓越华友医疗器械有限公司)，环球牌针灸针(半寸：0.25 mm×13 mm，苏州针灸用品有限公司)，英迪牌电子脉冲针疗仪(KWD-808-I型，常州英迪电子医疗器械公司)，光学显微镜(日本Nikon株式会社)，精密电子天平JA3000C (上海析域仪器设备有限公司),FS/FAS5030石蜡切片机(德国LETIZ公司)，凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，紫外分光光度仪(德国Eppendorf公司)，稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 模型制备

采用改良后Videman法[5]即左后肢伸直位固定制动法制备KOA型：空白组不造模，其余各组禁食10～16 h后，麻醉采用3%戊巴比妥钠溶液耳缘静脉30 mg/kg注射。麻醉期时，固定左后肢至完全伸直位。先以树脂绷带内附脱脂棉从腹股沟到足踝予以固定(膝关节伸直180°，踝关节跖伸60°)；再以高分子绷带在树脂绷带外缠绕1周以加强固定；待其硬化后外缠防啃咬绷带以防兔撕咬。留出足趾观察血供，如有坏死、发黑等立刻拆除树脂绷带，待肿胀消退后再重新开始；及时重新固定松动或脱落的树脂。累积制动6周，造模结束1周后开始干预。

1.4 分组及干预

将40只新西兰兔按随机数字表法分为空白组、模型组、电针组和针刀组4组，每组10只。空白组不做任何处理；模型组于造模后不做干预；电针组于造模1周后，在左膝部针刺点“血海-梁丘”“内膝眼-外膝眼” 连接电子脉冲针疗仪,穴位定位参照 《实验动物学》，疏密波,频率2/100 Hz，强度3 mA，20 min/次，3次/周，连续3周；针刀组于造模1 周后，以龙胆紫定位左膝关节股内、外侧肌止点和内、外膝眼，常规备皮消毒后于肌腱附着点处进针刀，刀口线平行于肌腱及肢体纵轴走向，刀体垂直皮肤刺入后，向肌肉附着点方向施以纵疏横剥松解，出针刀后加压片刻，2次/周，连续3周。

1.5 指标检测

1.5.1 体重检测 分别于造模前1天、造模结束1天后、干预结束1天后的上午8点(进食前)，采用电子天平进行体重测量，每次测量读数3次，取其平均值。造模期增长率=(造模后-造模前)/造模前，干预期增长率=(治疗后-治疗前)/治疗前。

1.5.2 病理观察 分别于干预结束1周后，以过量麻醉法处死并进行取材。于股骨内侧髁切取1 cm×1 cm新鲜软骨组织，投入10%福尔马林溶液中固定1周。10% EDTA脱钙1个月，石蜡包埋固定及切片(片厚5 μm)，常规 HE 染色，200倍光学显微镜下观察(切片：5张/组，视野：3个/张)。参照骨性关节炎软骨组织结构病理学分级 Mankin[9]评分法对关节软骨组织结构、细胞数量、软骨组织染色以及潮线情况进行评分并统计比较。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组兔不同时段体重检测

2.1.1 各组兔造模及干预前后体重 组内比较：4组造模后及干预后体重均比造模前显著升高(均P<0.01)；4组干预后体重均比干预前显著升高(均P<0.01)。组间比较：造模前，空白组、模型组、电针组及针刀组各兔体重组间比较未见显著差异(P>0.05)；造模后(干预前)，与空白组比较模型组、电针组及针刀组的体重均显著升高(P<0.05或P<0.01)；干预后：空白组、模型组、电针组及针刀组各兔体重组间比较未见显著差异(P>0.05)。见表1、图1。

表1 各组兔造模及干预前后体重比较

注：与空白组比较,aP<0.05,aaP<0.01；与模型组比较,bP<0.05；与电针组比较,cP<0.05；与造模前比较,dP<0.05,ddP<0.01；与干预前比较,eP<0.05,eeP<0.01

图1 各组兔造模及干预前后体重 注：与空白组比较,aP<0.05,aaP<0.01；与模型组比较,bP<0.05；与电针组比较,cP<0.05；与造模前比较,dP<0.05,ddP<0.01；与干预前比较,eP<0.05,eeP<0.01

2.1.2 各组兔造模期与干预期体重增长率 造模期增长率：各组造模期体重增长率组间比较未见显著差异(P>0.05)。干预期增长率：与空白组比较，模型组、电针组及针刀组的体重增长率显著降低(均P<0.05),与模型组比较，电针组体重增长率有减小趋势，但未见统计学差异(P>0.05),针刀组的体重增长率显著降低(P<0.05)。造模期与干预期比较，空白组、模型组二期间均未见显著统计学差异(P>0.05)，电针组、针刀组干预期增长率均比造模期显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表2、图2。

表2 各组兔造模期与干预期体重增长率比较

注：与空白组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05；与电针组比较,cP<0.05；与造模期比较,fP<0.05,ffP<0.01

图2 各组兔造模期与干预期体重增长率 注：与空白组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05；与电针组比较,cP<0.05；与造模期比较,fP<0.05,ffP<0.01

2.2 各组兔膝关节病理解剖观察

空白组关节软骨呈透明蓝白色，无裂纹及表面缺损，较少量关节液，质地清澈透明，滑膜色泽淡红无水肿。模型组关节软骨呈灰白色不透明，明显失去原有光泽，表面可见龟裂甚至缺损，明显滑膜增生及关节边缘纤维性粘连，关节液量明显增多，且呈泡沫状，浑浊。电针组软骨颜色较白透亮，未见龟裂及充血，部分滑膜增生黏连，关节液量较模型组明显减少。针刀组软骨颜色淡白，色泽较亮，部分可见龟裂，滑膜增生明显减轻，未见明显充血，关节腔内见少量清晰关节液。见封三彩图3。

2.3 各组兔膝关节软骨组织形态观察

空白组软骨呈现光滑连续的表面，基质着色均匀，细胞分层清晰有序、形态规则，细胞核呈深蓝色，胞浆及软骨基质呈粉红色；软骨结构完整、层次清晰，可见移行层、辐射层、钙化层，厚度正常，软骨细胞形态正常、纵轴与软骨表面垂直排列，潮线清晰完整，无软骨细胞簇集现象，无血管翳生成,见封三彩图4A。模型组软骨完整性被破坏、软骨基质染色减轻且不均匀，软骨细胞层次紊乱，表浅层软骨出现剥脱且软骨细胞减少，裂隙进入辐射层，局部出现簇集现象，厚度变薄，潮线模糊甚至断裂，部分见少量血管翳生成,见封三彩图4B。电针组软骨结构基本完整，软骨基质染色中度减少，软骨细胞弥漫性增生，排列紊乱，但4层较难分辨，厚度基本正常，潮线模糊不清，软骨层和软骨下骨层分界不清，未见血管翳生成,见封三彩图4C。针刀组兔软骨基质染色良好，软骨结构较清晰，可见移行层、辐射层、钙化层，表层软骨基质分层可见翻起，表层局部软骨细胞排列紊乱，辐射层软骨细胞排列规则，与软骨表面垂直，潮线较模糊，未见血管翳生成,见封三彩图4D。

2.4 各组兔膝关节软骨病理Mankin评分

在治疗后，与空白组比较，模型组、针刀组、电针组兔膝关节软骨Mankin评分均显著上升，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组进行比较，针刀组、电针组Mankin评分显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与电针组对比，针刀组Mankin评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组兔治疗后Makin评分比较分)

注：与空白组比较,**P<0.01；与模型组比较,##P<0.01；与电针组比较,▲P<0.05

2.5 各组兔体重改变与组织病理评分的相关性

散点图分析可见，膝关节软骨病理Mankin评分与造模前后、治疗前后的体重及造模期与治疗期体重变化率分别比较，各点呈不规则分布，均未发现显著的线性相关关系；并采用Pearson进行相关性检验，Mankin评分与造模前、造模后、治疗中、治疗后、造模期变化率、治疗期变化率的P值均大于0.05。见封三彩图5。

3 讨论

膝关节作为主要负重关节,直立行走时，其关节面的最大轴向作用力为2.3～7.1倍体重[2-3],前后方向受力为0.35～2.3倍体重[10-11],内外侧方向受力较少,为0.13～1倍体重[3,10]。研究发现正常状态,当人体在站立或运动行进中,下肢承受着体重并保持平衡，重力传导通过膝关节内侧,使之承受主要的压应力[12]。当体重过高会使膝关节的负荷增大，软骨磨损严重。故有学者研究发现高体重者比低体重者的膝骨关节炎发病率相差47倍[9]。2015年1项中国人群膝骨关节炎危险因素的Meta分析研究证实体重是KOA发病的重要危险因素，控制和减轻体重可以减少KOA的发生；如果一名女性体重减轻5 kg，将会使其膝关节发生KOA的概率降低50%[5-6]。同时减轻体重可显著减轻KOA患者的临床症状，如Egan BA等研究发现通过锻炼减轻体重可明显缓解膝关节的疼痛症状[7]。

膝关节表面软骨的存在使得关节得以润滑及避免关节面间的相互摩擦。光学显微镜下,正常关节软骨的纵切面可分为:表层或切线层、移行层、辐射层、软骨基质钙化层[13]。在辐射层与软骨基质钙化层之间有一条波浪形的潮线相隔,可以调节软骨面与体液交换[14]。膝关节骨性关节炎发生时关节软骨的完整性遭到破坏，镜下呈现层次紊乱、潮线模糊等病理表现[15]。本实验发现，空白组新西兰兔关节软骨肉眼观察呈蓝白色透明，色泽明亮无裂纹及缺损，关节液量较少，质地清澈透明，淡红色滑；镜下结构完整、层次清晰，无血管翳生成。经过6周的Videman法左后肢固定伸直位造模后，关节软骨明显失去原有光泽，呈灰白色不透明，可见龟裂甚至缺损，关节边缘纤维性粘连，滑膜增生明显，关节液量明显增多，且呈泡沫状，浑浊，但未见明显的骨赘生成。镜下软骨的完整性遭到破坏，潮线模糊甚至断裂，Mankin评分显著升高；说明KOA病早期的模型制备成功。而经过电针和针刀治疗后，肉眼解剖发生了明显的改善；且针刀的镜下层次较电针组更加清晰，染色良好；二者的Mankin评分均出现不同程度下降，说明针刀和电针均改善了KOA的早期病理表现，且针刀较电针更加显著。体重检测发现，在造模前4组新西兰兔体重未见显著差异，经过6周造模后各组体重均显著升高，且经过造模的要比空白升高幅度更大；经过4周干预后，各组体重进一步升高。说明从造模到干预期，各组体重均呈增长的趋势。对于同期不同组间的增长率进行比较发现，模型组、电针组及针刀组在治疗时期的体重增长率比空白组显著减小(P<0.05)，且针刀组的体重增长率显著减小(P<0.05)。造模期与治疗期的增长率比较发现，未经治疗的两个组体重未见差异，而针刀组和电针组于干预期的体重增长率均显著降低，且针刀组的增长率降低极显著；说明针刀和电针均可以降低KOA模型的体重增长率，且针刀效果更加显著。因此推测针刀及电针对KOA的治疗作用可能与其降低体重增长速度有关；通过降低增长的体重负荷来发挥软骨保护的作用，这也与以往理论及研究成果基本一致。

由于骨关节炎患者大多体重超重,且患病关节疼痛、僵硬,这就限制了患者患病关节的活动,从而引起患者相关活动量减少,这又可能导致患者体重进一步增加,从而在体重超重与骨关节炎之间形成了恶性循环[16]。但通过对体重、体重增长率与软骨的病理评分进行散点图分析可见，膝关节HE染色的Mankin评分与造模前、造模后、治疗中、治疗后、造模前后变化率、治疗前后变化率分别比较，各点均呈不规则分布，均未发现显著的线性相关关系；并采用Pearson进行相关性检验，Mankin评分与各期体重及其变化率相关性的P值均大于0.05；这似乎与上面结果及以往的研究矛盾，不能支持体重与KOA发病的相关性。但进一步查阅文献发现，除正常步态情况下,若人体于快步行走、上、下楼梯或举重物时,其膝关节的受力明显增加，髌股关节的受力在正常步态下为0.2～1.8倍体重[17-19],若是在跑步或跳跃时其可增大至约11倍体重[20]。孟维春等[21]通过实验证实异常的高应力或反复剧烈的重力负荷,作用于关节软骨会引起软骨基质胶原纤维网的疲劳和断裂,蛋白多糖随之丢失,软骨细胞暴露。说明活动状态是决定体重与KOA发病关系的关键因素[22]。而本实验中各组新西兰兔在适应性饲养、造模及治疗期均处于独立笼中，24 h封闭式饲养；各饲养笼体积不到80 dm见方，严格限制了兔的行走、跳跃等活动，这也一定程度限制了体重负荷对膝关节软骨的破坏作用，因此本实验相关性的结果也就不难理解；同时也进一步说明，控制剧烈活动可以显著降低体重负荷对人体膝关节的破坏作用。

综上，体重是膝骨性关节炎的重要风险因素；针刀和电针均可显著改善KOA兔模型膝关节早期炎性病理改变；通过控制体重的增长速度，达到保护KOA关节软骨的作用。同时适当的减少奔跑、跳跃或长距离行走等剧烈活动，可以有效降低高体重负荷对关节的磨损，间接起到保护膝关节的作用。