在线固相萃取—高效液相色谱—串联质谱法测定猪肉和羊肉中10 种β—受体激动剂

马俊美 孙磊 刘茁 沈璐 张冬生 贾文轩 李强 范素芳

摘 要：建立在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱检测猪肉及羊肉中10 种β-受体激动剂的全自动分析方法。样品于37 ℃酶解16 h后，经MCX在线固相萃取小柱净化，采用XBridge C18色谱柱分离，以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾电离正离子模式下，采用多反应监测模式检测，内标法定量。结果表明：10 种β-受体激动剂在0.01～10.00 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999 0；检出限为0.004～0.040 μg/kg，定量限为0.02～0.20 μg/kg；方法回收率为76.5%～107.7%，相对标准偏差小于10%。该方法分析速度快、灵敏度高，可用于猪肉和羊肉中10 种β-受体激动剂的定性及定量分析。

关键词：在线固相萃取；高效液相色谱-串联质谱法；β-受体激动剂；内标法定量

Determination of 10 β-Agonists in Pork and Lamb Samples by On-Line Solid Phase Extraction Coupled to

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Junmei1， SUN Lei1， LIU Zhuo2， SHEN Lu1， ZHANG Dongsheng1， JIA Wenxuan1， LI Qiang1，*， FAN Sufang1，*

（1.Hebei Food Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050000， China；

2.College of Bioscience and Bioengineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018， China）

Abstract： In this research， we developed a fully automated method to determine 10 β-agonists in pork and lamb using

on-line solid phase extraction coupled to high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

（HPLC-MS-MS）. After being enzymatically digested at 37 ℃ for 16 h， samples were purified by on-line solid phase extraction on an MCX column， and then separated on an XBridge C18 column by gradient elution using 0.1% formic acid solution and acetonitrile as the mobile phase. Mass spectrometric data were acquired under multiple reaction monitoring （MRM） mode using positive ion electrospray ionization. Quantitation was performed by the internal standard method. The results showed a good linear relationship in the concentration range of 0.01–10.00 ng/mL was achieved for all analytes with acorrelation coefficient higher than 0.999 0. The limits of detection （LOD） were in the range of 0.004–0.040 μg/kg and the limits of quantitation （LOQ） were in the range of 0.02–0.20 μg/kg. The recoveries of the method ranged from 76.5% to 107.7%， with relative standard deviation （RSD）lower than 10%. These results demonstrate that the method is simple， sensitive， and can be used for quantification of 10 β-agonists in pork and lamb samples.

Keywords： on-line solid phase extraction； liquid chromatography-tandem mass spectrometry； β-agonists； internal standard method

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805004

中圖分类号：O657.63 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）05-0019-07

引文格式：

马俊美， 孙磊， 刘茁， 等. 在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉和羊肉中10 种β-受体激动剂[J]. 肉类研究， 2018， 32（5）： 19-25. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805004. http：//www.rlyj.pub

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β-受体激动剂是一类化学合成的苯乙醇胺类物质，具有“再分配效应”，能够使生物体内的营养成分由脂肪向肌肉组织转移，导致体内的脂肪分解代谢增强、蛋白质合成增加、胴体瘦肉率提高。β-受体激动剂在动物体内的残留时间较长，可致使食用者发生呕吐、激动、失眠、食欲减退或心律失常等症状，严重时能诱导染色体畸变，引发癌症，对人体危害巨大[1-6]。因此，我国农业部第196号和235号公告均禁止β-受体激动剂作为生长促进剂用于畜牧业。

目前，国内外报道的动物源性食品中β-受体激动剂残留的检测方法主要有高效液相色谱（high efficiency liquid chromatography，HPLC）法[7-8]、酶联免疫法[9-10]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[11-13]及高效液相色谱-串联质谱（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[14-21]等。HPLC法灵敏度较差，酶联免疫法假阳性率高，GC-MS法的前处理过程比较复杂，HPLC-MS/MS法具有优异的定量与定性分析能力，已成为β-受体激动剂的主要检测和确证方法。国家标准GB/T 22286—2008《动物源食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质

谱法》[22]、行业标准SN/T 1924—2011《进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特步他林残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》[23]及农业部1025号公告-18—2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法》[24]等均采用HPLC-MS/MS法，然而，虽然这些标准中的方法能够满足分析要求的准确度，但均采用离线固相萃取技术，操作步骤非常繁琐，费时费力。

在线固相萃取是近年来基于固相萃取技术发展起来的一种全自动样品前处理技术[25-26]，可有效简化样品前处理过程，提高工作效率，同时保证方法的灵敏度与准确度。本研究采用Spark Holland公司的在线固相萃取装置，开发了一种全新的在线固相萃取技术，用于检测猪肉和羊肉中10 种β-受体激动剂的残留量，并采用内标法定量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸克伦特罗（纯度98.5%）、沙丁胺醇（纯度100%）、莱克多巴胺（纯度97.0%）、西马特罗（纯度99.0%）、妥布特罗（纯度99.0%）、盐酸喷布特罗（纯度99.0%）、非诺特罗（100 mg/mL）、特布他林（纯度98.5%）、氯丙那林（纯度99.0%）、苯乙醇胺A（纯度99.6%）、莱克多巴胺-D3（纯度97.1%）、沙丁胺醇-D3（纯度98.5%）、克伦特罗-D9（纯度99.0%）、苯乙醇胺A-D3（纯度99.7%）标准品 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、甲酸（均为色谱纯） 美国Fisher公司；乙酸铵（色谱纯） 美国Sigma公司；超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃） 美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

HySphere C18 HD在线固相萃取小柱（10 mm×1 mm） 荷兰Spark公司；MCX、HLB在线固相萃取小柱（10 mm×1 mm） 美国Waters

公司。

Symbiosis Pico全自动在线固相萃取系统 荷兰Spark Holland公司；AB SCIEX Triple Quad 6500液相色谱-质谱联用仪（配备电喷雾电离源）、MultiQuant 3.0.1數据处理软件 美国Sciex公司；CR22N高速冷冻离

心机 德国Hitachi公司；SHA-B恒温水浴振荡器

常州润华电器有限公司；Vortex Genius 3旋涡混合器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

分别称取适量克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、西马特罗、妥布特罗、喷布特罗、非诺特罗、特布他林、氯丙那林、苯乙醇胺A、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3、克伦特罗-D9和苯乙醇胺A-D3标准品于不同的100 mL容量瓶中，用甲醇定容，将各标准品配制成质量浓度均为100 μg/mL的标准储备溶液，-20 ℃保存，有效期为1 年。

用甲醇稀释标准储备溶液，将各标准品配制成质量浓度均为1.0 μg/mL的标准工作溶液，4 ℃保存，有效期为3 个月。

1.3.2 样品前处理

称取5 g试样，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入100 μL混合内标工作溶液（4 种内标物的质量浓度均为10 ng/mL）和10 mL乙酸铵缓冲溶液（2 mol/L），再加入40 μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，充分振荡混匀，37 ℃酶解16 h，酶解液于8 000 r/min条件下离心5 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤后，置于Spark进样器，待测。

1.3.3 在线固相萃取条件优化

目前常用于β-受体激动剂检测的离线固相萃取柱类型有MCX、HLB和C18[27-30]，本研究选取这3 种填料的在线固相萃取小柱，通过考察10 种β-受体激动剂标准品

（5 ng/mL）的出峰情况，选择合适的在线固相萃取小柱。

在上样量（50 μL）一定的条件下，考察不同洗脱溶剂（2%氨水甲醇和5%氨水甲醇）、洗脱速率（0.05、0.10、0.15、0.20 mL/min）和洗脱体积（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL）对目标化合物的洗脱效果，根据10 种β-受体激动剂标准品（5 ng/mL）的响应值和出峰情况选择合适的洗脱溶剂、洗脱速率和洗脱体积。

1.3.4 HPLC条件优化

分别选用乙腈水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液4 种体系作为流动相，考察相同洗脱程序下化合物的响应和出峰情况。在线净化过程中的洗脱溶剂为高比例有机相，流动相保持高浓度水相才能避免洗脱液在色谱柱入口处发生扩散，考察流动相中水相的初始比例为90%、95%和98%时目标化合物在色谱柱上的保留情况。

1.3.5 MS参数优化

通过针泵进样的方式，将10 种化合物的标准溶液（100 ng/mL）以7 μL/min的速率直接注入Triple Quad 6500质谱仪中，在电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）正离子模式（ESI+）下，对目标物进行Q1 MS全扫描，确定母离子，对母离子进行Product ion二级扫描，分别确定其定性和定量离子，再选择多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式对子离子的去簇电压、碰撞能量等参数进行优化。

1.3.6 方法的线性关系、检出限和定量限测定

分别准确移取适量10 种β-受体激动剂的标准储备溶液，置于同一容量瓶中，经甲醇稀释后配制成各β-受体激动剂的质量浓度均分别为0.01、0.02、0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00 ng/mL的系列标准混合溶液（含0.1 ng/mL的内标），采用优化后的条件进行测定。同时，采用空白样品中添加目标化合物的方法，以信噪比（RS/N）=3时目标化合物的浓度作为检出限（limit of detection，LOD），RS/N=10时目标化合物的浓度作为定量限（limit of quantification，LOQ）。

1.3.7 加標回收率测定

向空白猪肉基质和空白羊肉基质中添加10 种β-受体激动剂的标准储备溶液，进行加标回收率测定，添加水平分别为1 倍、2 倍、10 倍LOQ，同时计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。每个添加水平重复测定6 次。

1.3.8 与标准方法的比较

选取猪肉和羊肉阴性样品各1 份，以1 μg/kg的加标量，加入10 种β-受体激动剂标准储备溶液，分别采用本研究建立的方法（方法1）、GB/T 22286—2008（方法2）

和农业部1025号公告-18—2008（方法3）中的方法进行测定。每个样品平行测定3 次。

2 结果与分析

2.1 在线固相萃取条件的选择

相较于HLB和C18 2 款小柱，MCX在线净化小柱对酶解后的样品净化效果最好，加标回收率最高。β-受体激动剂结构中含有碱性β-羟胺侧链，在酸性条件下呈阳离子特性，可被MCX小柱有效吸附，用酸性甲醇将杂质进行淋洗后，再用碱性甲醇对目标物进行洗脱，能对酶解后样品起到很好的净化作用。

在上样量、洗脱速率和洗脱体积一定的条件下，考察2%氨水甲醇和5%氨水甲醇作为洗脱溶剂时对目标化合物的洗脱效果。结果表明，使用5%氨水甲醇作为洗脱溶剂时的回收率较高，故选用5%氨水甲醇作为洗脱溶剂。

当洗脱速率为0.05 mL/min时，色谱峰的峰型较差，出现严重拖尾；当洗脱速率增大至0.10 mL/min时，色谱峰的峰型良好，峰面积显著增大；洗脱速率继续增大时，洗脱效率降低，峰面积变小。故选择洗脱速率为0.10 mL/min。

在线净化过程中，洗脱体积与洗脱效果密切相关，直接影响回收率和色谱峰型。由图1可知：洗脱体积对10 种β-受体激动剂的影响显著，当洗脱体积为0.05、0.10 mL时，未能对目标物进行有效洗脱；随着洗脱体积的增大，10 种β-受体激动剂的峰面积逐渐增加，洗脱体积为0.20 mL时，峰面积最大；当洗脱体积继续增大时，峰面积趋于稳定。故选择洗脱体积为0.20 mL。

最终优化得到的在线固相萃取条件如表1所示。

2.2 HPLC条件的选择

本研究使用Symbiosis Pico全自动在线固相萃取系统，该系统由在线净化装置和液相色谱2 部分组成，2 部分独立运行，经过在线固相萃取净化后的样品采用HPD聚焦模式直接注入色谱柱进行分析。净化过程中的洗脱速率为0.1 mL/min，为避免总体速率变化较快而导致的压力波动，造成出峰异常，需要降低流动相的速率（由0.6 mL/min降至0.5 mL/min），使洗脱速率与流动相速率之和保持不变。

在ESI+条件下，加入甲酸有助于化合物的离子化，提高分离效率和MS信号强度。甲醇和乙腈作为流动相时对信号强度的影响均较小，但以甲醇作为流动相进行梯度洗脱时，色谱柱压力变化较大，平衡所需时间较长。故选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

流动相中水相的初始比例为90%时，沙丁胺醇和特布他林在色谱柱上有明显的扩散现象；流动相中水相的初始比例为95%时，所有化合物峰型良好；流动相中水相的初始比例为98%时的分类效果与水相的初始比例为95%时无差别。故选择流动相中水相的初始比例为95%。

最终优化得到的HPLC条件为：色谱柱：XBridgeTM C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温35 ℃；进样量50 μL；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；洗脱程序：0～0.05 min，0.6～0.5 mL/min，流动相B 5%；0.05～2.00 min，0.5 mL/min，流动相B 5%；2.00～2.05 min，0.5～0.6 mL/min，流动相B 5%；2.05～8.00 min，0.6 mL/min，流动相B 5%～90%；8.00～9.50 min，0.6 mL/min，流动相B 90%；9.50～10.00 min，0.6 mL/min，流动相B 90%～5%；10.00～12.00 min，0.6 mL/min，流动相B 5%。

2.3 MS参数的选择

优化后的MS参数为：离子化电压5.5 kV；离子源温度550 ℃；气帘气压力206.8 kPa；雾化器压力310.3 kPa；辅助气压力344.8 kPa。10 种β-受体激动剂的MRM参数如表2所示，色谱-质谱图如图2所示。

a. 氯丙那林；b. 西马特罗；c. 特布他林；d. 妥布特罗；e. 沙丁胺醇；

f. 克伦特罗；g. 喷布特罗；h. 莱克多巴胺；i. 非诺特罗；j. 苯乙醇胺A；k. 沙丁胺醇-D3；l. 克伦特罗-D9；m. 莱克多巴胺-D3；n. 苯乙醇胺A-D3。

2.4 方法的线性关系、LOD和LOQ

参照GB/T 22286—2008，苯乙醇胺A-D3作为苯乙醇胺A的内标物质，莱克多巴胺-D3作为莱克多巴胺的内标物质，沙丁胺醇-D3作为沙丁胺醇和特布他林的内标物质，克伦特罗-D9作为其余β-受体激动剂的内标物质。

由表3可知，10 种β-受体激动剂在0.01～10.00 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好，均满足相关系数≥0.999 0，LOD为0.004～0.040 μg/kg，LOQ为0.02～0.20 μg/kg，低于GB/T 22286—2008（LOD为0.5 μg/kg）和农业部1025号公告-18—2008（LOD为0.25 μg/kg）。

2.5 方法的加标回收率

由表4可知，10 种β-受体激动剂在猪肉基质中的加标回收率为76.5%～107.7%，RSD为2.4%～9.5%，在羊肉基质中的加标回收率为78.3%～102.1%，RSD为3.1%～9.2%。

2.6 与标准方法的比较结果

由表5可知，3 种方法的测定结果基本一致，而本研究中的方法在检测成本、测定效率、灵敏度和重复性等方面均优于标准方法。标准方法均采用离线固相萃取方法，固相萃取柱为一次性使用，单次检测成本较高，而在线固相萃取小柱可以重复进样，有效降低了检测成本；离线固相萃取过程需要经过活化、平衡、上样、淋洗、洗脱、氮吹、复溶等，步骤繁琐，且容易引入人為误差，本方法从在线固相萃取净化到完成分析仅需12 min，分析效率大大提高，且过程中流量、流速可控，自动化和简便化的操作更好地提高了方法的精密度和准确度。

2.7 实际样品测定结果

对购自当地超市的10 个猪肉样品和10 个羊肉样品中的10 种β-受体激动剂进行检测。结果表明，检测结果均为阴性，且本方法的测定结果与标准方法

（GB/T 22286—2008、农业部1025号公告-18—2008）的测定结果一致。

3 结 论

本研究采用在线固相萃取-HPLC-MS/MS方法，建立了猪肉和羊肉中10 种β-受体激动剂的全自动检测方法。酶解后的样品经过MCX在线固相萃取小柱净化，用HPLC-MS/MS结合内标法校正。该方法操作更加简便，有机溶剂使用少，极大缩短了检测时间，适用于猪肉和羊肉中10 种β-受体激动剂的含量测定，也为其他基质中其他β-受体激动剂的含量测定提供了参考。

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