莪术茎尖玻璃化法超低温保存技术

吴怡 顾雅坤 符丽 曾琳

摘 要 为莪术种质资源稳定保存提供一条新途径。 以莪术组培苗茎尖为试材，用玻璃化法进行超低温保存后， 于25℃用0.1% TTC溶液培养24 h后检测生活力。结果表明，切取2～3 mm长、继代培养60 d的莪术组培苗茎尖，避光条件下，用含0.3 mol/L蔗糖的MS固体培养基预培养7 d，室温下，茎尖用60%的PVS2装载液装载10 min，0℃用100%的PVS2玻璃化保护液对茎尖脱水处理30 min，快速投入液氮中进行超低温保存16 h；取出茎尖于40℃水浴中解冻2 min，室温下用US溶液洗涤20 min，立即用0.1% TTC溶液于25℃人工气候培养箱中培养24 h，莪术茎尖的生活力最高可达100%。表明该方法可用于莪术种质资源的保存。

关键词 莪术 ；茎尖 ；种质资源 ；玻璃化法 ；超低温保存

中图分类号 S567.239 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.04.010

Abstract Shoot tips of tissue cultured Curcuma zedoaria were subcultured， vitrified and cryopreserved to get a new approach for stable conservation of C. zedoaria. The test-tube plantlets of C. zedoaria were subcultured for 60 d， and their shoot tips were cut 2～3 mm long and cultured in the MS solid medium supplemented with 0.3 mol/L sucrose for 7 days in the dark. Then the shoot tips were loaded with 60% PVS2 for 10 min at 25℃， dehydrated for 30 min at 0℃ with 100% PVS2 as vitrification protection solution and placed immediately into liquid nitrogen for cryopreservation for 16 h. The cryopreserved shoot tips were thawed in aqueous bath for 2 min at 40℃， and rinsed with US solution for 20 min at the room temperature. The survival rate of the shoot tips was measured by using 0.1% TTC solution and the highest survival rate was up to 100.00%. This indicates that the vitrified cryopreservation may be used for preservation of germplasm resources of C. zedoaria.

Keywords Curcuma zedoaria ； shoot-tips； germplasm resources ； vitrification ； cryopreservation

莪術[Curcumazedoaria （Christm.） Rosc.]是姜科（Zingiberaceae）姜黄属（Curcuma）多年生草本植物[1]。根茎为中药莪术，有消食、行气解郁、止痛破淤及治疗妇女血淤闭经等功效，其所含姜黄素和挥发油还具抗氧化和抗肿瘤等作用[2]，姜黄素已被美国国立肿瘤所（NCI）列为第三代癌症化学预防药物[3]；而莪术中挥发油主要成分萜类化合物可诱导细胞周期停滞或者凋亡、抑制癌细胞转移和侵袭等[4]。由此可见，莪术的开发前景非常可观。目前莪术种质资源的保存方法主要为传统田间种植保存和组织培养保存。但传统田间种植保存需要占用大面积种植地[5]，易受自然灾害、病虫害影响，耗费大，且长期种植将引起种质资源退化、变异，导致优质种质资源丢失等；组织培养则需频繁进行继代培养，易造成样品污染、试管苗变异等[5]。因此，探索一种适用于莪术种质资源长期保存的新途径具有十分重要的意义。

超低温保存是指在-196℃液氮中保存生物材料的方法[6]。早在1897年，就有人尝试用-192℃的液态空气作为冷冻介质保存植物种子，后来由于液氮具有价格便宜、容易制得且性质稳定等特点而成为常用的超低温保存冷冻介质。超低温保存具有设备简单、容易操作、稳定性好及一次处理可以长期保存等诸多优点，在保存植物种质资源方面，有着无可比拟的优势[5]。目前，已有用液氮保存植物繁殖器官、营养器官、组织培养物、顽拗性或中间型种子等的先例[6]。在药用植物、果树以及园艺作物等方面也有诸多研究，如白木香[7]、益智[8-9]、高良姜[10]、降香黄檀、决明[11]、菊芋[12]；苹果、梨[13]、大蒜[14]、生姜[15]、土豆[16]等。不同植物，其取材、保存、前期处理等各不一样，但尚未见莪术种质资源玻璃化超低温保存的相关研究。本试验以莪术茎尖为材料，通过系统的超低温保存研究，拟建立一套适用于莪术种质资源的保存技术体系，为莪术种质资源长期稳定保存提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

切取温州莪术[Curcuma zedoaria （Christm.） Rosc.]（由国家南药基因资源库提供）地下茎块的幼芽进行组织培养，选取无污染、生长状况良好的试管苗，取茎尖作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 继代培养

将莪术试管苗置于丛生芽诱导培养基（含3.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤、1.0 mg/L吲哚乙酸、30 g/L蔗糖、1.0 g/L活性炭、6.5 g/L琼脂的MS培养基）中分别继代培养15、30、45、60 d。

1.2.2 预培养处理

切取长2～3 mm莪术试管苗茎尖，避光的环境下用含0.3、0.5、0.7 mol/L蔗糖的MS固体培养基分别预培养0、1、3、5、7 d。

1.2.3 装载液处理

用LS（含2 mol/L甘油、0.4 mol/L蔗糖的MS溶液）或60% PVS2（含0.15 mol/L蔗糖的MS溶液与100% PVS2按体积比40∶60混合）于25℃分别装载处理0、5、10、15、20、25、30 min。

1.2.4 玻璃化保护液处理

用100% PVS2（含30%甘油、15%乙二醇、15%二甲基亚砜、0.4 mol/L蔗糖的MS溶液），在0℃条件下，分别处理莪术茎尖15、30、45、60、90 min。

1.2.5 液氮冷冻

将经玻璃化保护液处理过的莪术茎尖迅速投入液氮中冷冻16 h。

1.2.6 水浴解冻及洗涤

取出莪术茎尖，在40℃水浴中分别解冻1、2、3、5、10 min；于25℃用US溶液（含1.2 mol/L蔗糖的MS溶液）洗涤20 min。

1.2.7 生活力检测

放入0.1% TTC溶液中，于人工气候培养箱中25℃培养24 h，洗净后用体视显微镜观察茎尖染色情况。

1.3 数据处理

本试验均为单因子试验，每处理15个带芽茎尖，3次重复。所有数据应用SPSS 19.0统计软件Duncan法和LSD法进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 莪术茎尖生活力检测

由图1所示，A、B为未进行玻璃化超低温保存（对照组）莪术茎尖，C、D为玻璃化超低温保存后的莪术茎尖。TTC作为氧化性的氢受体，可被活种子呼吸作用产生的脱氢辅酶还原成红色的物质，即有活性的茎尖会被染成红色。因此，茎尖染色情况可反映茎尖生活力。

2.2 继代培养时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响

继代培养能使组织细胞处于相同的生长阶段，减少试验材料个体差异带来的误差[15]。由图2可知，继代培养60 d，莪术茎尖超低温保存生活力最高；继代培养45、30 d，二者间超低温保存生活力差异不显著；继代培养15 d，莪术茎尖超低温保存生活力显著低于其他各处理。

2.3 预培养时间、培养基蔗糖浓度及装载液对莪术茎尖超低温保存的影响

预培養能使莪术茎尖组织中自由水含量降低，以适应超低温保存的脱水处理，增加细胞膜通透性，使冰冻保护剂快速渗透到细胞内。由表1可知，未进行预培养的莪术茎尖超低温保存后生活力为0，可能是由于茎尖中细胞含水量太高，超低温保存形成大量冰晶造成细胞损伤，导致没有生活力。当培养基中蔗糖浓度相同时，超低温保存后生活力随着预培养时间的增加而增加，这可能是由于预培养时间增加，细胞内含水量相应减少，超低温保存时形成冰晶越少，细胞损伤越小，生活力越高。预培养时间为1 d，超低温保存后生活力随着培养基中蔗糖浓度的增加先增加后减少。而预培养时间为3、5、7 d时，超低温保存后生活力随着培养基中蔗糖浓度的增加逐渐减少。说明预培养过程中，培养基中蔗糖浓度过高，会使茎尖组织失水过多，细胞内渗透压升高，原生质体过度收缩，导致细胞损伤甚至死亡，从而使超低温保存后生活力反而下降。综合考虑，莪术茎尖在蔗糖浓度0.3 mo/ L的培养基中预培养7 d后，用60% PVS2进行装载处理，超低温保存后生活力最佳。

2.4 装载液处理时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响

由图3可知，随着装载液（60%PVS2）处理时间的增加，莪术茎尖超低温保存后生活力先增加后减少。可能是由于装载液处理莪术茎尖，使细胞内水分减少，增加细胞渗透性。当预处理时间不够时，细胞内含水量高，在超低温保存过程中结冰，不利于莪术茎尖存活；而预处理时间太长，细胞过度脱水，超低温保存前莪术茎尖就受到了损伤，生活力下降。因此，装载液处理的最佳时间为10 min。

2.5 玻璃化保护液处理时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响

由图4可知，随着玻璃化保护液（100% PVS2）处理时间的延长，莪术茎尖超低温保存后生活力呈现先增加后减少的趋势。当玻璃化保护液处理30 min时，生活力最高；处理15 min，细胞脱水效果较差，细胞内含水量较高，超低温保存后生活力低；超过30 min，细胞脱水过度，细胞内渗透压升高造成损伤，且随着处理时间增加，冰冻保护剂乙二醇和二甲基亚砜对细胞毒害作用越明显，导致超低温保存后生活力下降。可见，玻璃化保护液对莪术茎尖的最佳处理时间为30 min。

2.6 40℃水浴解冻时间对莪术茎尖超低温保存生活力的影响

由图5可知，随着水浴解冻（40℃）时间的延长，莪术茎尖超低温保存生活力先增加后减少，其中解冻时间为2 min时，生活力最高。可能是由于此时细胞内冰晶完全融化，细胞内和玻璃化保护液温度已升至结冰温度以上，不会产生二次结冰的现象或者形成较少冰晶，对莪术茎尖伤害最小。而解冻时间较短时，玻璃化保护液温度仍很低，又或细胞内冰未完全融化，细胞内有可能二次结冰形成冰晶，细胞受到机械损伤，导致莪术茎尖超低温保存后生活力低。而随着解冻时间的增加，细胞完全解冻，可防止莪术茎尖在解冻过程中因再次结冰冻伤，但茎尖在玻璃化保护液中暴露的时间也相应增加，冰冻保护剂对莪术茎尖细胞的毒害作用越明显，生活力又随之降低。

3 讨论

玻璃化超低温保存法能长时间保存种质资源，且组织材料的生长状况、脱水程度、迅速冷冻、解冻与超低温保存后存活率密切相关。继代培养能使细胞分裂分化程度保持一致，提高保存的存活率[15]。脱水程度与组织材料预培养、装载液和冰冻保护剂处理时间等因素有关。水浴解冻能使超低温保存材料连同冰冻保护剂快速越过晶核形成温度而不形成冰晶或者较少形成冰晶，避免冰晶形成对细胞带来的机械损伤[17]。

Siliva等[18]对巴西植物Byrsonima茎尖进行15 d继代培养，玻璃化超低温保存后再生率最高达90%。王贞等[19]用继代培养了30 d的圆瓣扶芳藤茎尖进行玻璃化超低温保存，恢复培养后成活率为75%。赵艳华等[20]用继代培养了70 d的苹果茎尖进行玻璃化超低温保存，解冻后材料的存活率可稳定在60%。用继代培养了120 d的李试管苗茎尖进行超低温保存后，存活率在60%以上[21]。本试验用继代培养60 d的莪术组培苗茎尖进行玻璃化法超低温保存，其生活力最高。

培养基中蔗糖浓度高能降低试验材料组织细胞的含水量，减少超低温保存结冰对细胞膜及细胞器的损伤。Helianthus tuberosus L.茎尖在进行超低温保存前，用含0.4 mol/L蔗糖的液体MS培养基对茎尖进行3 d预培养，品种“Shudi”菊芋茎尖存活率和再生率分别高达93%、83%[12]；用含0.3 mol/L蔗糖的MS固体培养基对百合茎尖预培养1 d，成活率为87.5%[22]；用含0.7 mol/L蔗糖的培养基对李的离体茎尖进行预培养1 d，存活率达60%以上[21]；用含0.3、0.5、0.7和1.0 mol/L蔗糖的培养基对高山红景天茎尖预培养1 d，超低温保存成活率均接近100%[23]。本试验用含0.3 mol/L蔗糖的MS培养基对莪术茎尖避光预培养7 d，再进行玻璃化超低温保存，生活力最高。

用装载液和玻璃化保护液处理试验材料，可使茎尖进一步脱水，有效防止冻害。室温下用60% PVS1处理怀山药（Dioscorea opposita Thunb.）带芽茎尖60 min， 0℃用100% PVS1脱水处理60 min，超低温保存后成活率为77.14%[24]；25 ℃用LS处理三角叶薯蓣茎尖20 min，0 ℃用100% PVS2脱水90 min，超低温保存后存活率为83%[25]；用100% PVS2对葡萄茎尖脱水处理30 min，超低温保存后再生率为57%[26]。本试验中，25℃用60% PVS2预处理10 min，0℃用100% PVS2溶液脱水处理30 min，玻璃化超低温保存的生活力最高。其中，装载液（60% PVS2）和玻璃化处理液（100%PVS2）均含有冰冻保护剂乙二醇和二甲亚砜，在冷冻时形成玻璃态，可减少细胞内冰晶的形成，防止在冷冻过程中细胞器、细胞膜以及细胞壁冻坏，提高超低溫保存生活力。

解冻方法、解冻时间是影响试验材料超低温保存存活率的另一重要因素。生姜玻璃化超低温保存后，用37～40℃水浴解冻2 min的成活率为57.7%[15]；用38～40℃水浴解冻超低温保存后秦艽休眠芽的成活率接近100%[27]；王艾平等[28]用25、40、45℃ 3种温度解冻超低温保存的红芽芋茎尖，其中40℃水浴解冻3 min成活率最高，约为80%。李娟[29]对日本小果树HASKAOP茎尖进行玻璃化超低温保存研究发现，40℃水浴解冻60 s，成活率可高达66.67%。本试验发现，将玻璃化法超低温保存后的莪术茎尖用40℃水浴解冻2 min，生活力最佳。

总之，对莪术茎尖进行玻璃化超低温保存是可行的。但该保存法对莪术的遗传稳定性、药用成分的表达是否有影响等，还有待进一步研究。

参考文献

[1] 中国科学院中国植物志委员会. 中国植物志 （第16卷）[M]. 北京：科学出版社，1981.

[2] 王 琰，王慕邹. 姜黄属常用中药的研究进展[J]. 中国药学杂志，2001，36（2）：80-84.

[3] 王 颖. 中药郁金姜黄莪术的化学成分比较研究[D]. 重庆：重庆大学，2014.

[4] Lu J J， Dang Y Y， Huang M， et al. Anti-cancer properties of terpenoids isolated from RhizomaCurcumae--a review[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2012， 43（2）：406-411.

[5] 吴黎明，曾继吾，彭抒昂，等. 香蕉茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生[J]. 园艺学报，2006，33（3）：501-506.

[6] 文 彬. 植物种质资源超低温保存概述[J]. 植物分类与资源学报，2011，33（3）：311-329.

[7] 刘军民，徐梓勤，徐鸿华，等. 白木香种子的超低温保存研究[J]. 广州中医药大学学报，2007，24（5）：414-415.

[8] 曾 琳，何明军，陈 葵，等. 益智种子超低温长期保存方法探究[C]//中国作物学会. 中国作物学会作物种子专业委员会2015年学术年会会议论文集. 北京：中国作物学会作物种子专业委员会，2015.

[9] 曾 琳，吴 怡，何明军，等. 超低温冷冻对益智种子生理生化特性的影响[J/OL].广西植物，2017[2017-06-13]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.

1134.Q.20170613.1758.002.html.

[10] 曾 琳，何明军，陈 葵，等. 高良姜种子超低温保存研究[J]. 中国农学通报，2014，30（28）：164-168.

[11] 曾 琳，何明军，顾雅坤，等. 五种豆科药用植物种子超低温保存技术研究[J]. 氨基酸和生物资源，2017，39（1）：42-47.

[12] Zhang J M， Han L， Lu X X， et al. Cryopreservation of Jerusalem artichoke cultivars using an improved droplet-vitrificationmethod[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 2017， 128（3）： 1-11.

[13] Niino T， Sakai A， Yakuwa H， et al. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of apple and pear by vitrification[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 1992， 28（3）： 261-266.

[14] 王艷军，李锡香，向长萍，等. 大蒜茎尖玻璃化法超低温保存技术研究[J]. 园艺学报，2005，32（3）：507-509.

[15] 杜来顺，冯建军，李晓华，等. 生姜玻璃化法超低温保存技术[J]. 北方园艺，2014 （13）：123-125.

[16] Chen Q. Study on Cryopreservation Technology of Potato Stem Tip by Vitrification[J]. Heilongjiang Agricultural Sciences， 2014 （8）： 12-17.

[17] 王君晖，黄纯农. 玻璃化法-园艺作物茎尖和分生组织超低温保存的新途径-文献综述[J]. 园艺学报，1994 （3）：277-282.

[18] Silva L C， Paiva R， Swennen R， et al. Shoot-tip cryopreservation by droplet vitrification of Byrsonimaintermedia A. Juss.： a woody tropical and medicinal plant species from Brazilian cerrado[J]. Cryo Letters， 2013， 34（4）： 338-348.

[19] 王 贞，高健洲，刘 燕. 扶芳藤茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生[J]. 植物生理学报，2007，43（2）：303-304.

[20] 赵艳华，周锡明，吴永杰. 苹果离体茎尖超低温保存方法的比较[J]. 园艺学报，2003，30（6）：719-721.

[21] 赵艳华，吴雅琴，程和禾，等. 李离体茎尖的超低温保存[J]. 园艺学报，2008，35（3）：423-426.

[22] Yi J Y， Gian L， Jongwook C， et al. Efficient cryopreservation of Lilium spp. shoot tips using droplet-vitrification[J]. Plant Breeding & Biotechnology， 2013： 131-136.

[23] 刘剑锋，阎秀峰，程云清，等. 高山红景天（Rhodiolasachalinensis A.Bor）茎尖包埋-玻璃化法超低温保存与植株再生[J]. 浙江大学学报，2007，33（3）：265-270.

[24] 李明军，洪森荣，徐 鑫，等. 怀山药种质资源的玻璃化法超低温保存[J]. 作物学报，2006，32（2）：288-292.

[25] Mandal B B， Dixit-Sharma S. Cryopreservation of in vitro shoot tips of Dioscoreadeltoidea Wall.， an endangered medicinal plant： effect of cryogenic procedure and storage duration[J]. Cryo Letters， 2007， 28（6）： 460-470.

[26] Ganino T， Silvanini A， Beghé D， et al. Anatomy and osmotic potential of the Vitis rootstock shoot tips recalcitrant to cryopreservation[J]. Biologia Plantarum， 2012， 56（1）： 78-82.

[27] 张延红. 秦艽和党参的休眠芽培养与玻璃化超低温保存研究[D]. 兰州：甘肃农业大学，2013.

[28] 王艾平，尹明华，洪森荣，等. 红芽芋茎尖的包埋玻璃化法超低温保存[J]. 植物分类与资源学报，2015，37（6）：801-812.

[29] 李 娟. 日本小果树HASKAOP离体茎尖玻璃化法超低温保存的研究[D]. 呼和浩特：内蒙古农业大学，2012.