IAA和ABA对荔枝体胚成熟的影响

王果 李焕苓 吉训志 王家保

摘 要 研究了不同浓度的IAA和ABA组合对不同荔枝品种体胚成熟的影响。结果表明：在培养基中添加IAA和ABA对‘紫娘喜体胚成熟无明显作用，体胚均未萌发，但有利于‘妃子笑体胚成熟。‘妃子笑体胚在附加0.5 mg/L IAA与1.0 mg/L ABA的培养基上萌发效果最佳，多为单茎胚，萌发率最高，达59.6%；植株生长健壮，颜色深绿，展叶率最高，达38.6%；根系良好，多分根，生根率达62.1%。

关键词 荔枝 ；胚性愈伤组织 ；体胚发生 ；再生植株

中图分类号 S667.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.04.002

Abstract Somatic embryos from different cultivars of litchi （Litchi chinensis Sonn.） were treated with combinations of IAA and ABA at different concentrations to observe their maturity. The results showed that the addition of IAA and ABA in the culture medium had no obvious effect on the maturation of the somatic embryos of litchi cultivar‘Ziniangx， and failed to induce the germination of the somatic embryos， but was conducive to maturation of the litchi cultivar ‘Feizixiao. The best effect occurred in the medium supplemented with 0.5 mg/L of IAA and 1 mg/L of ABA for‘Feizixiao， and most of the somatic embryos were developed into a single stem with the highest germination rate of 59.6%. The plantlets were dark green， and grew better with the highest leaf emergence rate （upto 38.6%）. The plantlets were well rooted with numerous lateral roots， and the rooting rate was up to 62.1%.

Keywords litchi （Litchi chinensis Sonn.） ； embryogenic callus ； somatic embryogenesis ； plant regeneration

高效离体再生技术体系是转基因技术开发的基础。关于荔枝转基因技术的研究报道较少，瓶颈在于未能建立高效、稳定的离体再生技术体系。体胚发生是植物离体再生的重要途径，而对于多数木本植物而言，体胚的成熟和萌发是建立体胚离体再生技术体系时的主要难题[1]，大部分木本植物从体胚发生到萌发还需经过体胚成熟阶段。林秀莲等[2]认为，龙眼从体胚发生到萌发阶段需要至少2个月的时间，方可形成正常苗。沈庆斌等[3]指出，枇杷子叶胚需经过高糖成熟培养后才可形成苗。滕世云等[4]发现，枇杷子叶胚只能发育至蝌蚪状苗，随后变褐、停止发育，可能与其未经过体胚成熟阶段有关。在前人先后建立的‘妃子笑等15个荔枝品种的离体再生技术体系中，体胚均经过成熟培养[5-16]，但仍存在体胚萌发率低的难题，原因可能是畸形胚过多。本课题组前期研究发现，来源于花药的‘妃子笑、‘紫娘喜荔枝胚性愈伤组织易于诱导出体胚，‘妃子笑体胚发生数量巨大，但高度不同步且体胚形状、大小差别较大；‘紫娘喜次生胚产生率较高。体胚发生不同步、畸形胚及次生胚的产生在一定程度上抑制了体胚的正常成熟与萌发。大量研究[17-18]证明，IAA、ABA 2种激素对体胚的发生及成熟起正向促进作用。傅连芳等[5]、吕柳新等[6]研究发现，低浓度的IAA能在较短时间内促使荔枝胚状体增大。ABA被广泛用于促进针叶树子叶胚发育成熟的培养基中[19]。有报道认为，ABA能有效控制芒果[20]、葡萄[21]等畸形胚的产生。本研究拟探讨不同浓度IAA和ABA组合对不同荔枝品种体胚成熟的影响，以期为建立高效、稳定的荔枝离体再生技术体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

‘妃子笑和‘紫娘喜胚性愈伤组织分别为2015年春和2013年春以花药为外植体经诱导、筛选所得。

1.2 方法

1.2.1 体胚的诱导、成熟与萌发

将‘妃子笑和‘紫娘喜胚性愈傷组织分别接种在附加5 mg/L ZT、100 mL/L椰汁、0.4 g/L水解乳蛋白与0.1g/L肌醇的MS培养基上诱导体胚发生[16]。

待体胚发生约45 d时，选取直径为0.8～1.5 cm的各类型体胚接种到附加不同浓度激素（IAA和ABA）的MS培养基（表1）中暗培养75 d，培养温度（25±1）℃，之后转接于1/2 MS的萌发培养基上，以10 000lx光照培养，培养温度（25±1）℃；培养60 d时观察、记录各项指标，了解IAA和ABA不同浓度组合对体胚成熟及萌发的影响。每个处理接种20瓶（共约90个体胚），每1瓶为1次重复，即每处理重复20次。

根据萌发胚所抽茎数目多少将萌发胚分为单茎胚、多茎胚与玻璃化苗胚，单茎胚即为仅抽出一条单茎的体胚，多茎胚为抽出多条茎段的体胚，玻璃化苗胚为抽茎或者抽叶玻璃化的体胚。

根据萌发胚是否展叶分为展叶胚与无叶胚，展叶胚即具有完整叶片的体胚，无叶胚即仅仅抽出茎段但未展开叶片的体胚。

单茎胚率=单茎胚数/萌发胚数×100%；

多茎胚率=多茎胚数/萌发胚数×100%；

玻璃化苗胚率=玻璃化苗胚数/萌发胚数×100%；

展叶胚率=展叶胚数/萌发胚数×100%；

无叶胚率=无叶胚数/萌发胚数×100%；

萌发率=萌发胚数/接种体胚总数×100%；

生根率=生根胚数/接种体胚总数×100%。

1.3 数据处理

每处理20次重复，取各平均值，采用DPS数据处理系统[22]对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 体胚发生、成熟与萌发的形态观察

胚性愈伤组织在体胚发生培养基上培养后陆续可见白色小体胚，并逐渐长大。‘妃子笑体胚发生时间较‘紫娘喜早，且体胚数量大，正常体胚形态明显。在体胚成熟初期，有些体胚体积逐渐增大，色泽乳白、鲜亮，个体饱满；有些体胚则继续增殖，产生一定数量次生胚；个别体胚渐长出愈伤组织，或个别体胚干瘪，底部变褐。将完全成熟的体胚转接到萌发培养基后，由暗培养改为光照培养，体胚由乳白色逐渐转绿，而后萌发成苗。正常的双子叶胚经约10 d的培养即开始抽茎展叶，形成具有根茎叶的完整植株。随着体胚在成熟培养基上培养时间的延长，部分体胚在胚芽处以交错方式分化出茎，逐渐形成一种多茎叶胚的弯曲花朵状结构；部分体胚2片子叶的发育不同步，导致仅形成单片叶子或者叶片肥厚且肉质化；部分体胚分化出对称生长的叶片，叶片细长、颜色深绿。大部分体胚抽茎后未展叶，有些表现为单茎未展叶，有些为多茎未展叶，该类胚经培养可以部分展叶；另外有些体胚表现为芽点布满整个胚的抽茎表面，经进一步培养可分化出茎（图1-a～1-h）。

‘紫娘喜体胚多为形态不规则的近球状胚，在成熟培养基上，成熟缓慢，大部分体胚不见膨大，而是反复产生一定数量且多为子叶形态分明的小次生胚，形成一个个不同步的体胚簇生体。此类次生胚子叶薄，与母体轻度相连，易脱落，将它们与母体分离或带着母体切块分离培养时，由于体胚过小，其生长发育受到阻碍，常褐化死亡。体胚簇生体在光照下逐渐变绿，无抽茎萌发；或有个别体胚膨大，在光下延展出1～3条玻璃化绿色茎段，随着培养时间延长也未见能展叶，相反，大部分体胚从底部开始变褐死亡（图1-k～1-l）。

2.2 不同培养基对不同荔枝品种体胚成熟的影响

2.2.1 对‘妃子笑荔枝品种的影响

从表 1 中可看出，对于‘妃子笑荔枝品种而言，在C19培养基上其成熟的体胚萌发效果最佳，植株生长健壮，颜色深绿，萌发率、展叶胚率均达最高，分别为59.6%与38.6%。体胚多为单茎胚，根系良好，多分根，生根率达62.1%，侧根平均数目达3.2条/株（图1-i～1-j）。

在C18培养基上成熟的体胚萌发率达49.3%，多茎胚率最高，为46.7%；生根率最大，为64.2%。在该成熟培养基上培养的体胚整体干燥，渐褐，多为无叶胚，体胚玻璃化率较高。

在C12与C14培养基上体胚萌发率较高，分别为46.1%、44.8%；在这2种培养基上体胚展叶均较少，多为单茎无叶胚。C12体胚玻璃化最严重，达20.2%。C12与C14培养基上体胚生根率以及侧根平均数目均较C18、C19的低。

在C16培养基上体胚萌发率、展叶胚率与多茎胚率分别为34.6%、18.5%、26.9%，体胚玻璃化率为11.1%，主根平均长度较短。

在C11、C13与C15培养基上体胚萌发率相差不大，分别为29.6%、29.3%与28.9%，但其展叶情况不同，C11培养基上体胚无展叶，且3种培养基中其体胚玻璃化最严重，单茎胚居多；C13与C15培养基上体胚展叶胚率分别为7.9%、12.5%，C15多茎胚最少，多茎胚率为6.3%；C13茎段平均长度最短；在C11、C13与C15 3种培养基上的体胚主根及分根明显，其生根率依次为41.0%、50.0%与47.4%。

在C17培养基上体胚萌发率最低，仅为26.9%，其体胚展叶也较少，展叶胚率仅为3.3%，体胚全无玻璃化，多为单茎胚。

2.2.2 对‘紫娘喜荔枝品种的影响

不同处理下‘紫娘喜体胚全无萌发。

2.3 不同浓度激素组合对不同荔枝品种体胚成熟的影响

从表2中的成苗率、单茎胚率与多茎胚率可以看出，单一的IAA或ABA激素对‘妃子笑体胚成熟及体胚出茎数目影响均不显著，但IAA与ABA互作对体胚成熟及单茎胚或多茎胚的影响显著。且当ABA 浓度达1.0 mg/L及IAA 为0.5 mg/L时（C19）体胚萌发率、单茎胚率最高，分别为59.6%与73.0%；当ABA 浓度为1.0 mg/L及IAA 为0.1 mg/L时（C18）多茎胚率最高，为46.7%（表1）。IAA及IAA与ABA互作对体胚展叶有极显著影响，当添加低浓度ABA时，体胚展叶胚率随着IAA浓度的增加而增大，当ABA浓度为1.0 mg/L、IAA浓度为0.5 mg/L时体胚展叶胚率最大，为38.6%。

本研究同时发现，ABA、IAA与ABA互作对玻璃化苗胚及主根平均长度影响不显著，对体胚茎段平均数目有一定影响；ABA对侧根平均数目及分根率有影响，IAA对体胚侧根平均长度、茎段平均长度及生根率有影响。

综上所述，‘妃子笑体胚最合适的成熟培养基是附加 0.5 mg/LIAA及 1.0 mg/L ABA的MS培养基。

不同激素组合处理下，‘紫娘喜体胚全无萌发，生根较少，稀有分根。

3 讨论

体胚形态高度不同步化现象在其他植物体胚发生中均有存在，但是不同植物中又有其特殊性，如金花茶体胚发生过程中多芽体胚较常见[23]，苹果离体叶片体胚发生过程中可见到单子叶胚、双子叶胚、三子叶胚、杯状胚、多子叶胚、畸形胚等各种形态胚[24]；爬山虎97%都为畸形胚，主要是连体胚、芽端畸形胚和超度含水状胚[25]。畸形胚在体胚发生过程中较为常见，但关于畸形胚产生的机理还缺乏深入的研究。一是认为，与其染色体数目变异有关，但大部分研究认为是与培养基中激素种类、质量浓度有关，并且通过调节愈伤组织状态、体胚发生及成熟培养基上的激素种类和浓度，能减少畸形胚的产生或使畸形胚萌发转化为正常苗。Kong等[26]和黄学林等[27]认为，ABA是针叶树种体胚成熟的关键因子，其作用主要是促进体胚成熟，防止裂生多胚及畸形胚的产生。对湿地松[28]、苜蓿[29]等的研究也表明，ABA是影响体胚产量和质量的关键因素。胡玉玲等[30]研究指出，IAA对油茶体胚萌发影响最大。García-Martín等[31]研究表明，IAA与ABA在栓皮栎体胚成熟及萌发中起重要作用；Feher等[32-33]研究也表明，IAA与ABA在不同植物体胚成熟及萌发中起关键作用。本研究发现，单独添加0.5 mg/L ABA時，‘妃子笑体胚成熟效果较佳，体胚萌发率为44.8%；当另外添加0.5 mg/L IAA且ABA质量浓度提高至1.0 mg/L时，体胚成熟效果最好，萌发率达59.6%，此时生根率也较大。但是不同浓度IAA与ABA组合对‘紫娘喜体胚成熟无明显影响，‘紫娘喜次生胚及畸形胚还是较多。由此可见，‘妃子笑、‘紫娘喜体胚成熟所需IAA、ABA浓度组合有很大差异，因而不同品种胚性愈伤组织体胚成熟的适宜培养基还有待深入研究。

此外，本研究还发现，体胚发生过程中衍生一种假珠芽的结构，在一些子叶过度膨大的胚芽处及一些萌发的茎端处有类似结构产生。笔者认为，假珠芽可能是芽发育受阻的单极胚，发育后期往往只见胚根伸长或产生变态茎，其维管发育不好，没有芽原基，但有表皮结构和根原基。离体培养中出现的这种变态现象有待于进一步探讨。

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