苦荞D-手性肌醇提取物抑制NOX4活性及提高血管舒张作用

2018-09-26张波波高彩凤李云龙

食品科学 2018年17期

张波波，高彩凤，李云龙，王敏,*

内皮功能紊乱是血管形态及结构损伤的病理基础[1]，也是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等多种疾病发生的早期环节[2-3]，且预防内皮功能紊乱是预防或治疗相关代谢性疾病的有效手段[4-5]。大量研究显示，高脂饮食导致的脂代谢紊乱，尤其是血清中过高游离脂肪酸引起的氧化应激是导致内皮功能紊乱的主要原因之一[6-8]。

NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）介导的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一种“kindling radicals”，能够引起其他途径ROS的大量产生，如黄嘌呤氧化酶及一氧化氮合酶[9-10]。NOX家族共有7 个成员，其中NOX1、NOX2、NOX4、NOX5等亚型大量表达于内皮细胞中[11-12]，然而NOX4在内皮细胞中具有最高的表达量[13-14]，在引起内皮功能障碍及动脉粥样硬化中有关键作用[15]。说明抑制NOX4是减轻或预防内皮功能紊乱的重要策略。

苦荞具有预防心血管疾病、糖尿病等功效[16-17]，究其原因很可能是其生物活性物质保护内皮功能起效。苦荞除富含淀粉、蛋白、多酚、黄酮外，还富含D-手性肌醇（D-chiro inositol，DCI）[18]。DCI是机体自身存在的物质，在以内皮功能紊乱为主要特征的糖尿病、多囊卵巢综合征等患者体内严重缺乏[19-20]，且补充DCI能显著改善高血压或糖尿病状态下内皮氧化应激及功能紊乱[21-22]。但是DCI是否同样能减轻非糖尿病等疾病状态，如高脂刺激下内皮功能障碍，且DCI保护内皮功能的作用机制尚不明确，因此本实验通过考察高脂及苦荞麸皮提取物（tartary buckwheat bran extract，TBBE）对体外内皮细胞、离体血管、在体动物血管中NOX4活性的影响，观察对血管内皮依赖性舒张的改变作用。探讨提取物在高脂状态下对内皮功能的保护作用，为苦荞等富含DCI食物的有效利用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级体质量200～250 g左右的SD大鼠及雄性5～6 周龄的ICR小鼠，饲养于中国药科大学中药药理教研室SPF级动物室（许可证号：SCXK（Su）2012-0004）。高脂饲料由质量分数（下同）0.2%胆盐、1%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄、78.8%基础饲料组成。

TBBE（含35.7 g/100 g水、33.5 g/100 g DCI、0.33 g/100 g芦丁，未检测到槲皮素（＜0.02 g/100 g）），由山西农业科学院农产品加工研究所提供。

二苯基氯化碘盐（diphenyleneiodonium chloride，DPI）、乙酰胆碱美国Sigma公司；苯肾上腺素 TCI（上海）化成工业公司；棕榈酸（palmitic acid，PA）国药集团化学试剂有限公司；MTT、DCFH-DA探针碧云天生物技术研究所；Anti-NOX4 德国Abcam公司；游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）试剂盒、血糖试剂盒南京检测生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

荧光酶标仪及细胞培养箱美国赛默飞公司；超净工作台苏州安泰空气技术有限公司；倒置生物显微镜重庆光学仪器厂；稳压稳流电泳仪南京科宝仪器研究所；转膜仪及垂直电泳槽美国Bio-Rad公司；离体组织器官恒温灌流系统、生物机能实验系统成都台盟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 内皮原代细胞的提取及培养

参照Li Yi等[6]的方法，并稍作修改。取SD大鼠乙醚麻醉后颈椎脱臼处死，75%体积分数乙醇溶液灭菌处理，在超净台中取出大鼠的胸主动脉，浸泡于含105U/L肝素钠的DMEM培养液中，轻轻剥离血管外周结缔组织和脂肪，使血管内膜外翻并扎紧其两端，用2 mg/mL的I胶原酶处理1.5 h（放于37℃的细胞培养箱中），取出血管将血管两端剪掉，其他部分剪为长、宽均为2 mm的小块，内膜部分紧贴培养瓶底部，加入1 mL左右培养基，6 h后补加培养基，2～3 d即可观察到内皮细胞爬出。选择3～6 代细胞进行实验。

1.3.2 离体血管分组及PA处理

同1.3.1节剥离大鼠胸主动脉血管。设置空白组、PA刺激组、5.381 μg/mL的TBBE保护组及1 μmol/L的DPI保护组。空白组：大鼠胸主动脉血管用含有10%血清的DMEM培养基孵育2.5 h。PA刺激组：大鼠胸主动脉血管用含有10%血清的DMEM培养基孵育0.5 h后，添加PA（100 μmol/L）再孵育2 h。TBBE保护组：大鼠胸主动脉血管用含有5.381 μg/mL TBBE的DMEM培养基（10%血清）孵育0.5 h后，添加PA（100 μmol/L）再孵育2 h。DPI保护组：大鼠胸主动脉血管用含有1 μmol/L DPI的DMEM培养基（10%血清）孵育0.5 h后，添加PA（100 μmol/L）再孵育2 h。

1.3.3 小鼠分组及饲喂

设置空白组、高脂饲喂组、高脂饲喂+TBBE（76.47 mg/kg）灌胃组、高脂饲喂+TBBE（149.3 mg/kg）灌胃组、高脂饲喂+200 mg/kg的二甲双胍（metformin，Met）灌胃组5 组，每组各10 只小鼠，共灌胃14 d。空白组：小鼠采用正常饲料饲喂，每天灌胃质量分数0.3%的羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）。高脂饲喂组：小鼠采用高脂饲料饲喂，每天灌胃0.3%的CMC-Na。TBBE灌胃组：小鼠采用高脂饲料饲喂，每天灌胃用CMC-Na（0.3%）配制的不同剂量的TBBE（74.67 mg/kg或149.3 mg/kg）。Met灌胃组：小鼠采用高脂饲料饲喂，每天灌胃用CMC-Na（0.3%）配制的Met（200 mg/kg）。

小鼠胸主动脉血管的剥离：不同组别小鼠饲喂14 d后，颈椎脱臼处死，体积分数75%的乙醇溶液灭菌处理，迅速剖开小鼠腹腔，找到并小心取出小鼠胸主动脉血管。

1.3.4 MTT法考察提取物对细胞活性的影响

将1.3.1节中获得的内皮细胞接种于96 孔板，待生长约60%融合度的时候，对细胞进行不同剂量TBBE孵育（24 h），按照MTT试剂盒使用说明处理细胞，以570 nm波长处空白组细胞吸光度为100%，考察TBBE对细胞活性的影响。

1.3.5 细胞ROS及NOX4检测

将1.3.1节中获得的内皮细胞接种于48 孔板，待生长约80%融合度的时候，对细胞进行不同剂量TBBE孵育及PA处理，使用DCFH-DA探针考察TBBE对细胞ROS产生的影响。将细胞接种于6 孔板，待生长约80%融合度的时候，对细胞进行不同剂量TBBE孵育及PA处理，提取细胞蛋白并定量，预先制备Western blot分离胶及浓缩胶，加入蛋白样品，电泳，转膜，对聚偏氟乙烯膜进行封闭、一抗及二抗孵育，压片及显影，考察提取物对NOX4蛋白活性的影响。

1.3.6 免疫组化分析大鼠离体血管及小鼠血管内膜NOX4表达

收集1.3.2节中空白组、PA孵育及TBBE、DPI处理的大鼠胸主动脉，及剥离1.3.3节中空白组、高脂饲喂及TBBE、Met灌胃处理小鼠的胸主动脉血管。

离体血管（大鼠）及在体血管（小鼠）经磷酸盐缓冲液清洗后，分别使用4%聚甲醛固定。对血管进行脱水，石蜡包埋，切片，脱水处理，再使用二甲苯和不同浓度乙醇溶液对切片进行脱蜡处理，柠檬酸缓冲液蒸煮切片20 min使抗原暴露，滴加体积分数3% H2O2溶液消除内源性过氧化氢酶减少背景，用3% BSA在湿盒中对切片进行封闭1 h，依次对切片进行一抗（anti-NOX4）、二抗及SABC孵育，滴加DAB显色剂，苏木素复染，不同浓度乙醇溶液及二甲苯对切片进行脱水处理，封片。显微镜下观察提取物对血管内膜NOX4表达的影响。

1.3.7 大鼠血管内皮依赖性舒张的检测

参照Li Jia等[24]的方法，略作修改。如1.3.1节剥离及处理大鼠胸主动脉血管，放入K-H液中，制备为1 cm长的血管环，悬挂在37 ℃预热的K-H液浴槽的两根相同长度且平行放置的钢丝间，通入95% O2及5% CO2，打开生物机能实验系统收集血管张力信号，调节血管基础张力2 g，平衡1.5 h。

先用60 mmol/L氯化钾处理10 min使血管收缩，K-H液冲洗血管使之恢复至基础张力，重复使血管收缩、恢复基础张力共3 次，加入1×10－6mol/L苯肾上腺素使血管处于收缩状态10 min，添加1×10－5mol/L乙酰胆碱，若血管舒张大于80%，可认为其内皮功能完整。选取内皮功能完整的血管环与5.381 μg/mL的TBBE或1 μmol/L的DPI共孵育30 min，继而加入100 μmol/L PA处理30 min，K-H液冲洗使之恢复基础张力，加入1×10－6mol/L苯肾上腺素导致血管收缩10 min，依次累积添加1×10－9、1×10－8.5、1×10－8、1×10－7.5、1×10－7、1×10－6.5、1×10－6、1×10－5.5、1×10－5mol/L乙酰胆碱舒张血管。记录并计算空白组、PA处理组、TBBE干预或DPI干预组血管舒张率。血管舒张率根据式（1）计算。

1.3.8 小鼠血清及组织指标的检测

两周后，禁食8 h，称小鼠体质量，摘眼球取血，收集并获得血清，检测血糖及FFAs水平，收集附睾脂肪及肝脏并称质量，分别根据公式（2）、（3）计算附睾脂肪系数及肝脏系数。

1.4 数据处理

Western blot图及免疫组化图使用Image-Pro Plus 6软件扫描光密度值。实验所得数据表示为 ±s，进行ANOVA方差分析和t检验，PS软件作图。P＜0.05及P＜0.01均表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 苦荞麸皮DCI对内皮细胞活性的影响

图1 TBBE剂量对细胞存活状态的影响Fig. 1 Effect of TBBE concentration on the viability of cells

如图1所示，以空白组细胞相对存活率为100%，低于50 μg/mL对细胞相对存活率没有显著影响，100.00 μg/mL则降低细胞活性。因为0.053 81、0.538 1、5.381 μg/mL的TBBE分别相当于0.10、1.00、10.00 μmol/L的DCI，这也是大多细胞研究采用的剂量[22]；因此，本研究中采用0.053 81～5.381 μg/mL剂量TBBE进行后续的细胞实验。

2.2 苦荞麸皮DCI对内皮细胞氧化应激的影响

NOX4是内皮细胞中含量最多的NOX亚型[14]，NOX活性的高低显示了细胞氧化应激的水平，其激活是导致细胞氧化应激的重要原因[25]，也是内皮功能损伤的重要诱导因素[26]。因此，进一步考察TBBE对内皮细胞氧化应激及NOX4相对活力的影响。

图2 TBBE抑制PA引起的细胞ROS产生（A）及NOX4相对活力（B）Fig. 2 TBBE inhibited PA-induced ROS production (A) and NOX4 relative activity (B) in cells

本研究结果表明（图2A），PA处理导致内皮细胞ROS水平显著升高，而不同剂量TBBE干预有效降低细胞内ROS的水平（P＜0.01）。且阳性药DPI（NOX活性抑制剂）显著降低ROS水平。说明药理抑制NOX活性能有效抑制细胞氧化应激，然而TBBE降低ROS的作用是否与抑制NOX活性有关，仍需进一步考察。

由图2B可知，PA组显著提高内皮细胞NOX4的表达（P＜0.01），而NOX4表达提高即意味着其活性升高，说明PA引起ROS产生依赖于对NOX4的激活，3 种剂量的TBBE干预组均有效抑制NOX4相对活力。虽然研究报道苦荞具有抑制氧化应激的作用[27]，且黄酮多酚等是苦荞食品中重要的抗氧化物质[28]，但该提取物富含DCI，仅含0.33 g/100 g的芦丁，未检测到槲皮素（小于0.02 g/100 g）。提示DCI可能是TBBE发挥功能的物质基础，TBBE可通过调节NOX4相对活力抑制细胞氧化应激。

2.3 苦荞麸皮DCI对离体血管内膜NOX4及血管舒张的影响

由于TBBE显著抑制内皮细胞氧化应激。但在离体组织中提取物是否有相似作用，是否进而可以保护内皮功能，因而对离体血管进行免疫组化分析NOX4相对活力并考察提取物对血管舒张的影响。

图3 TBBE抑制PA引起的大鼠离体血管内膜NOX4相对活力Fig. 3 TBBE inhibited PA-induced NOX4 relative activity in thoracic aorta of rats in vitro

由图3可知，与空白组相比，PA刺激组离体血管内膜部分棕色颜色加深，即NOX4表达升高，而5.381 μg/mL的TBBE干预组血管内膜NOX4表达减少，DPI组显示出与TBBE组相似的抑制NOX4相对活力的作用。说明TBBE可以在离体组织层面抑制NOX4相对活力，并可能抑制氧化应激。

图4 TBBE促进血管的内皮依赖性舒张Fig. 4 TBBE restored the loss of endothelium-dependent relaxation of thoracic aorta

不同处理组的血管舒张率见图4。空白组表示血管内皮功能完整，PA刺激后血管舒张率极显著降低（P＜0.01），说明PA具有刺激损伤内皮功能。TBBE干预组血管舒张率与PA组相比有显著提高，说明TBBE改善高脂状态下内皮功能紊乱现象。DPI与TBBE有相似作用。

苦荞中多种成分，如芦丁、槲皮素、中肌醇、DCI等均可抑制氧化应激，进而保护内皮功能[22-23]。由于本研究中TBBE富含DCI，仅含有0.85 g/100 g的中肌醇及微量芦丁物质，因此提示TBBE保护内皮的作用极有可能是DCI起到了主要作用，且TBBE通过抑制NOX4活性从而改善离体血管舒张作用，进一步阐明苦荞预防心血管疾病的机理。

2.4 苦荞麸皮DCI对在体小鼠血管内膜NOX4及相关指标的影响

因为细胞及离体组织均是体外研究，因此希望在体内进一步验证TBBE对小鼠内皮功能及其他指标的影响。因而考察TBBE对HFD小鼠血管内膜NOX4及对小鼠血清葡萄糖、FFAs、附睾脂肪系数、肝脏系数及体质量的影响。

图5 TBBE抑制HFD引起的小鼠血管内膜NOX4相对活力Fig. 5 TBBE inhibited HFD diet-induced NOX4 relative activity in thoracic aorta of mice in vivo

由图5可知，高脂处理提高了小鼠血管内膜部分棕色颗粒的增多，即NOX4相对活力升高，灌胃74.67、149.3 mg/kg（相当于25、50 mg/kg的DCI）的TBBE有效降低了小鼠血管内膜部分NOX4的相对活力，可能进一步抑制HFD小鼠血管氧化应激现象。

表1 提取物对小鼠血清指标及组织系数的影响Table 1 Effect of TBBE on blood glucose, FFAs, and epididymal fat coefficient, liver coefficient and body mass of mice

由表1可知，HFD引起小鼠血清中FFAs浓度显著升高，提示高脂造成过量FFAs可能与小鼠血管内皮细胞NOX4相对活力升高有关。而不同剂量TBBE能有效降低血清中FFAs的水平，该作用可能有助于TBBE在高脂状态下抑制内皮细胞氧化应激并保护内皮功能。另外，高脂饲喂14 d并没有引起小鼠血糖水平升高，说明此时小鼠模型处于非高血糖或糖尿病状态。高脂饲喂以及提取物灌胃处理对小鼠附睾脂肪系数、肝脏系数及体质量均无显著影响，说明此时小鼠没有出现肥胖等现象。本部分研究显示，TBBE可以逆转非糖尿病或非肥胖状态下高脂引起的内皮功能损伤，也进一步揭示了合理食用苦荞具有保护内皮功能。

内皮是多种疾病的始动环节，且预防内皮功能紊乱有效延缓相关疾病的发生[4-5]。大量文献表明，荞麦具有治疗动脉粥样硬化[29]、减轻高血压症状[30]及降低高血糖[31]等作用，但本研究提出富含DCI的苦荞提取物具有保护高脂状态下内皮功能的作用，该活性可能有助于苦荞预防或治疗多种以内皮功能紊乱为早期特征的疾病，如心血管疾病及糖尿病等。