黄芪甲苷对大鼠肝星状细胞氧化损伤的作用研究

王 键,宋瑞鹏,孙 丹

肝脏氧化应激损伤能引起肝星状细胞结构及功能改变，而肝星状细胞活化是引起肝纤维化的主要原因[1]。故寻找能够有效延缓或减轻肝星状细胞氧化应激损伤的药物是本领域研究的热点。黄芪甲苷是从黄芪中提取的重要单体，具有改善血管内皮细胞功能，调节微循环，提高超氧化物歧化酶活性，稳定细胞膜的作用[2-5]。本研究探讨黄芪甲苷对肝星状细胞氧化应激损伤的作用及相关机制，以期为肝纤维化的治疗开辟新的研究方向。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂 黄芪甲苷(Sigma公司，纯度为97%)，大鼠肝星状细胞株HSC-T6 (中国科学院上海生命科学研究院细胞库)，H2O2(美国Sigma公司)，RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)，MTT试剂盒(上海伯奥生物科技有限公司)，H2DCFDA染色试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)，Hoechst-PI双染试剂盒(南京建成生物研究所)，Caspase-3、Caspase-9抗体(上海碧云生物技术有限天公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养：肝星状细胞培养在RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清和1%双抗)中，培养箱内温度为37℃，CO2体积分数为5%；每天观察细胞的生长状态，2～3 d换液1次。

1.2.2药物处理及实验分组：对照组不做任何处理,氧化损伤组用100 μmol/L的H2O2孵育24 h,黄芪甲苷低浓度组用100 μmol/L黄芪甲苷孵育24 h后加入100 μmol/L 的H2O2孵育12 h,黄芪甲苷高浓度组用200 μmol/L黄芪甲苷孵育24 h后加入100 μmol/L的H2O2孵育12 h。

1.2.3MTT法测定细胞增殖情况：取处于对数生长期的肝星状细胞接种于96孔板中，细胞密度为1×104个/L，每孔200 μl，向各孔细胞中加入10 μl MTT(5 g/L)，4 h后吸出上清液，加入100 μl DMSO溶液，低速振荡10 min后在酶联免疫检测仪上测定各孔570 nm的光密度(OD)值。

1.2.4流式细胞术检测肝星状细胞内活性氧(ROS)表达：肝星状细胞接种于6孔培养板，0.1%胰酶消化各组细胞后制备细胞悬液。1000 r/min离心后收集细胞，加入5 μl H2DCFDA染料后充分混匀避光反应15 min，于1 h内用流式细胞仪检测细胞内ROS表达量。

1.2.5Hoechst-PI染色观察细胞凋亡：肝星状细胞接种于12孔培养板，细胞经相应处理后用PBS洗涤2次，在150 μl的Binding Buffer中加入2 μl Hoechst-PI染液，避光、室温反应5 min后置于荧光显微镜下观察结果并拍照。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6Caspase-3及Caspase-9含量检测：用0.1%胰酶消化细胞，1200 r/min离心10 min，收集细胞并用PBS冲洗2次，加入30 μl细胞裂解液后冰上孵育20 min，10 000 r/min离心10 min，按试剂盒说明书，使用721 D分光光度计测定细胞内Caspase-3及Caspase-9含量。

2 结果

2.1肝星状细胞活性变化 氧化损伤组经H2O2处理后，细胞活性为(30.00±3.50)%，对照组为(96.67±2.98)%。氧化损伤组的细胞活性低于对照组(P<0.01)。用不同浓度黄芪甲苷处理后，低浓度和高浓度组的细胞活性分别提高到(54.00±4.22)%和(68.00±3.60)%，均高于氧化损伤组(P<0.01)。不同浓度黄芪甲苷组细胞活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1黄芪甲苷对H2O2致肝星状细胞活性的影响

注：与氧化损伤组比较，bP<0.01

2.2肝星状细胞内ROS表达变化 对照组细胞内ROS表达均较低，氧化损伤组DCF荧光信号明显增强，不同浓度黄芪甲苷干预后，荧光信号强度逐渐减弱。见图2。

图2 4组肝星状细胞内活性氧含量流式细胞学检测结果

2.3肝星状细胞凋亡情况 未发生凋亡反应的细胞核为均匀一致的低蓝色荧光，凋亡细胞为亮蓝色荧光，坏死细胞为红色荧光。荧光显微镜下可见正常细胞核内染色质浓缩、边集，呈亮蓝色高荧光。氧化损伤组凋亡细胞数量增多，甚至出现红染的坏死细胞。氧化损伤组凋亡细胞比例为(68.00±3.56)%，对照组为(2.00±1.42)%。氧化损伤组凋亡细胞比例高于对照组(P<0.01)。黄芪甲苷干预后，凋亡及坏死细胞逐渐减少。黄芪甲苷低和高浓度组凋亡细胞比例分别为(51.67±4.86)%和(50.67±3.28)%，低于氧化损伤组(P<0.05，P<0.01)。不同浓度黄芪甲苷组凋亡细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 4组肝星状细胞凋亡情况(Hoechst-PI染色 ×300)

2.4肝星状细胞内Caspase-3及Caspase-9的含量变化 氧化损伤组肝星状细胞内Caspase-3及Caspase-9表达高于对照组(P<0.05)；黄芪甲苷干预后，肝星状细胞内Caspase-3及Caspase-9表达水平低于氧化损伤组(P<0.01)。黄芪甲苷低浓度组与高浓度组肝星状细胞内Caspase-3及Caspase-9含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 黄芪甲苷对肝星状细胞内Caspase-3及Caspase-9含量变化的影响

注：与对照组比较，aP<0.05；与氧化损伤组比较，bP<0.05

3 讨论

为了研究肝纤维化病变的发生机制并探索出更多的治疗性药物，国内外学者尝试了大量方法诱导肝星状细胞凋亡，如：高糖、化学药物、H2O2等[6-7]。为了能更接近人体环境，本研究模拟肝纤维化患者体内环境中肝星状细胞的氧化应激状态，利用100 μmol/L的H2O2建立细胞氧化损伤模型，观察黄芪甲苷对肝星状细胞的保护作用。

黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分，具有提高记忆力、延缓衰老、调节免疫、抗肿瘤等作用，临床主要用于糖尿病、心血管疾病的治疗[8-10]。目前，临床关于黄芪甲苷治疗肝脏疾病的报道并不多，顾明等[11]通过制备大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型后给予黄芪甲苷10～40 mg/(kg·d)腹腔注射进行干预后发现，黄芪甲苷通过抑制Caspase-3及Caspase-9表达，减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤。本研究采用100 μmol/L和200 μmol/L的黄芪甲苷处理鼠肝星状细胞24 h，发现黄芪甲苷能够有效抑制H2O2引起的肝星状细胞内ROS增加，提示黄芪甲苷具有抑制细胞氧化损伤的作用。黄芪甲苷干预的肝星状细胞活性增加，凋亡细胞比例降低，提示黄芪甲苷能够抑制肝星状细胞凋亡反应的发生。

细胞凋亡是指在病理或者生理因素的影响下，通过激活膜信号通路及启动相关程序基因，在降解酶、蛋白酶、核酸酶的作用下，导致细胞按一定程序控制的破坏和死亡[12-15]。核酸内切酶首先被激活，引起细胞内基因组DNA的降解，产生大小不等的核苷酸片段等特征性改变[16]。线粒体与细胞凋亡密切相关，当线粒体内膜通透性改变时，细胞色素C从线粒体内膜脱落并流失到细胞质中，从而启动了细胞的凋亡过程[17]。细胞色素C与细胞凋亡的关系十分密切，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1和Caspase-9组成了凋亡复合体，共同活化Caspase-3，作用于不同的靶目标，最终引起细胞凋亡[18]。本研究中，黄芪甲苷作用于肝星状细胞后，Caspase-3和Caspase-9表达相对于氧化损伤组均降低，提示黄芪甲苷通过改变抗凋亡因子表达抑制了肝星状细胞凋亡。

综上所述，黄芪甲苷有望成为治疗肝脏纤维化的有效药物，为该病的临床治疗提供新思路。