利用LIBS技术区分皮内痣组织与真皮组织

祝 铭，陈秉灵，罗 腾，王梦涵，詹淑霞，刘丽炜，屈军乐，Tymish Y OHULCHANSKYY

1)深圳大学光电工程学院，光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 广东深圳 518060；2)深圳市蛇口人民医院皮肤科， 广东深圳 518067

激光已被广泛用于美容除痣手术．相比传统的手术除痣，激光除痣创面小、出血量小且手术时间短．但是，现有的激光除痣技术在手术中依然是依靠医生的肉眼来辨别病变组织，所以常发生因病变组织清除不完全而导致复发的情况．本研究提出采用激光诱导击穿光谱(laser-induced breakdown spectroscopy, LIBS)辅助激光除痣手术，实现在除痣手术的同时完成病变组织与正常组织的识别，进而达到一次性完成除痣手术，避免复发．

黑色素细胞性痣非常常见，通常无害，绝大多数患者不需治疗．痣通常依据黑色素细胞的分布来分类，当黑色素细胞只位于真皮层时，称为皮内痣(intradermal nevus)；当黑色素细胞位于表皮层及表皮层和真皮层的交界区域时，称为交界痣(junctional nevus)；当黑色素细胞同时分布在表皮层和真皮层中，称为混合痣(compound nevus)[1]．由于黑色素细胞性痣的治疗通常是出于美容与健康原因， 因此该技术必须有效且安全．黑色素细胞性痣切除方法包括手术切除、冷冻切除和激光切除[2-3]．近年来，激光手术被广泛用于痣组织切除．该技术可精确破坏痣组织，包括深度控制，因此能实现最小的创伤面积，且因为激光与病变组织的非接触模式减少了伤口感染的几率[4-5]．但是，外科医生通常只是通过目测来确认病变组织是否被完全清除，而手术中的病变组织与正常组织的边界模糊，需采用化学分析方法才能完全确认，这样就无法做到实时诊断．因此，现有技术手段很难在激光除痣手术中做到完全切除病变组织[6]．不完全切除的残留细胞存在向恶性病变组织转化的可能．据估计，2014年美国76 100例皮肤恶性黑色素瘤病例中有9 710例死亡[7]，这些死亡病例中约1/3 患者是黑色素瘤疾病的复发，其中，21.8%的复发患者的黑色素瘤是在相同地方复发[8]．文献[9]展示的19例病例中就有两例是由原发性黑色素瘤切除术不完全切除而引起的局部复发[9]．为避免此类复发，成像技术已被纳入研究范畴，如光学相干层析成像 (optical coherence tomography, OCT)．然而，OCT技术很难被用于实时切除组织的分析．有研究引入智能外科手术的概念，在手术中应用LIBS作为实时反馈光谱信息的工具[10]．LIBS是一种原子发射光谱，它应用脉冲激光束聚焦到样品表面使其剥蚀，产生等离子体，采集并分析等离子体光谱即可判断样品的物质元素组成．使用LIBS对组织进行实时光谱反馈，通过调节激光的能量和激发脉冲数量，可实现深度方向的光谱分辨[11]．

本研究通过对人体痣组织与真皮组织的LIBS检测结果，分辨痣组织与皮内痣组织，实现将皮内痣组织与周围真皮组织区分，并在激光除痣手术的同时完成组织光谱识别的实时反馈，以解决当下激光除痣手术不能完全清除痣组织的现状．

1 实 验

1.1 实验系统

LIBS实验装置及原理如图1．其中，Nd∶YAG纳秒脉冲激光器(型号为Beamtech, Nimma 600)发出波长为1 064 nm的脉冲激光，由半波片和格兰泰勒棱镜组成的激光能量调节器来控制激光能量．实验采用的单脉冲能量为85 mJ，激光频率为5 Hz，200 ms的脉冲间隔时间可保证样品在上一个脉冲照射后能回复到室温，并接收下一束激发脉冲．通过一个10倍的物镜把1 064 nm激光聚焦到样品表面形成等离子体，再由物镜收集等离子体的发射光谱；通过一个880 nm二相色镜将激发光与等离子体发射光谱分离，由透镜将等离子体发射光谱聚焦到光纤再传输到单色仪(Andor, SR303i)和增强型电子耦合器件(intensified charge coupled device, ICCD)(型号为Andor, iStar ICCD DH320T-180-03)进行分光和光电转换等信号转化过程．

图1 LIBS实验系统装置实物图及原理图Fig.1 (Color online) LIBS detection system and its schematic diagram

1.2 样品准备

实验所用样品为病人除痣手术中从皮肤上切下的病变组织，每个痣约为黄豆颗粒大小且形状不规则．所用样品组织包括皮内痣样品4个、真皮组织样品4个．图2(a)为痣组织样品，沿图中虚线切一个薄片，显微镜下如图2(b)．由图2(b)可见，黑色素细胞位于真皮层中，因此可归类为皮内痣．样品组织由一个弹簧夹子固定在三维平移台上．对每个样品采集5个不同探测点的单脉冲LIBS光谱，其结果作为训练模型所需数据．得到模型后再对4组8个样品中的每个样品采集10组LIBS光谱，用以验证模型．光谱波长390 nm探测区域包含Ca元素特征峰和C—N特征峰，590 nm区域包含Na元素特征峰．

图2 手术切除的皮内痣组织样品及皮内痣组织的病理显微照片Fig.2 (Color online) A sample of an intradermal nevus tissue removed from surgical operation and its microscopic photograph

2 结果与讨论

皮内痣组织与真皮组织的LIBS光谱对比如图3(图中的光谱图是每个样品5次测量的平均值)．光谱包含3个元素的发射光谱：C—N峰对应384～390 nm，Ca峰对应392～398 nm，Na峰对应588～591 nm[12]．由图3可见，真皮组织在Na元素和Ca元素的光谱峰强度明显高于皮内痣组织．

图3 真皮组织和皮内痣组织的LIBS图Fig.3 (Color online) LIBS of dermal tissue and intradermal nevus

痣细胞是黑色素细胞的变种，比典型的黑色素细胞大[13]．细胞中的Ca2+和Na+主要分布在细胞外液中[14]．在痣组织中由于黑色素细胞的体积较大，激光光斑照射到的细胞数量相对于皮肤组织要少，激光光斑范围内的细胞外液比例也要小．因此，可以推断真皮组织的Ca2+和Na+的LIBS信号强于皮内痣组织的原因是，在真皮组织中激光激发的细胞外液比例大于皮内痣组织．

钙水平在哺乳动物体内受到严密调控，并以骨头作为其主要存贮站点．Ca2+在受控条件下从骨头释放到血液中，通过血液传输作为溶解的离子或被绑定到蛋白质，如血清白蛋白[15-16]．细胞内外钠、钾离子浓度存在显著差异．Na+在胞外液中的浓度明显高于胞内．由此可知，Ca2+和Na+主要位于细胞外液中．由于痣细胞中的黑色素聚集，导致其比正常的皮肤细胞要大很多，因此相同体积内的细胞外液含量降低，造成Ca2+和Na+浓度在LIBS测量痣组织和真皮组织时出现差异．因此，本研究选择Na的原子发射峰Na I 为589.0 nm和589.6 nm，Ca的原子发射峰Ca II 为393.4 nm和396.8 nm作为两个比较差异的核心参量．

本研究采用线性分类器来确定决策域的分界面，核心的准则函数采用Fisher线性判别分析(linearity distinction analysis，LDA)．Fisher线性分析在光谱快速识别中已被广泛应用[17-18]．为降低数据维度，选择Ca的原子发射峰强度Ca II为393.4 nm和396.8 nm之和作为参数1；Na的原子发射峰强度Na I为589.0 nm和589.6 nm之和作为参数2．从原子发射光谱的原理出发，选择两峰值强度之和与选择单峰值强度作为参数并无区别．但由于实验中探测器存在随机的暗噪声，所以选择两个峰值之和会比选择单峰值信噪比更高．具体的数学模型就是设计分界超平面函数

g(X)=WT+ω0

(1)

其中，WT为超平面的法向量；ω0为超平面平移的阈权值；X为样本特征向量，第i份样品测试结果为

(2)

其中，intensity()为求LIBS强度值函数．本研究的模型有两组样品共40个测量样本，其中真皮样品组和皮内痣组织各20个．

WT又称投影方向，通过样本训练来确定，可使原样本向量在该方向上的投影尽可能保证类间离散度最大和类内离散度最小.

(3)

其中，J(W)为不同种类间的距离；mi为各类样本均值向量，

(4)

Si为各类样本类内离散度矩阵，

Si=∑(X-mi)2，i=1,2

(5)

Matlab编程计算的线性判别函数为

(6)

将待测数据代入线性判别式中，若g(X)>0， 归类为真皮组织；否则，g(X)<0， 归类为皮内痣组织．对4组8个样品进行测试，每个样品测试5次，得到如图4的以散点形式表示的40个训练样本数据．图中斜线为线性判别函数．

图4 40个训练样本的真皮组织和皮痣组织CaⅡ峰和NaⅠ峰的分散分布训练结果Fig.4 (Color online) LIBS Intensity of CaⅡ and NaⅠ scatter distribution training results chart of the dermal tissue and intradermal nevus for 40 training samples

得到判据的分界函数后，再对8个样品中的每个样品另行采集10次，得到80组数据．应用所获得的区域界限进行区分，来验证分界函数是否准确，结果如图5．由图5可见，80组数据中分类失败的数据有2组，即判断成功率为97.5%．可见，通过LIBS光谱中的Ca与Na的特征峰，本研究基本实现了皮内痣组织与真皮组织的区分．

图5 80个训练样本的真皮组织和皮痣组织CaⅡ峰和NaⅠ峰的分散分布测试结果Fig.5 (Color online) LIBS Intensity of CaⅡ and NaⅠ scatter distribution test results chart of the dermal tissue and intradermal nevus tissue for 80 training samples

结 语

本研究以临床皮肤病变组织切除手术中的皮内痣组织为研究对象，分别对4组病人的皮内痣组织与真皮组织做了LIBS光谱检测与分析．Ca2+和Na+主要位于细胞外液中，由于痣细胞中的黑色素聚集，导致痣细胞比正常的皮肤细胞要大很多，致使相同体积内的细胞外液含量降低，也造成了Ca+和Na+浓度在LIBS测量痣组织和真皮组织时出现差异．采用Ca元素在393.4 nm和396.8 nm与Na元素在589.0 nm和589.6 nm的特征峰建立数学模型，然后应用模型将皮内痣组织与真皮组织区分开，区分成功率达97.5%．该方法首次将LIBS光谱技术用于临床病变组织实时分辨中，有望在未来的临床医学中发挥重要作用．