PIK3CA及GST—π在人骨肉瘤中的表达及其临床意义

丁万军 黄莉 曾涛 戈伟 张煜坤 郭卫春 余铃

[摘要] 目的 检测磷脂酰肌醇3激酶（PIK3CA）及谷胱甘肽-S-转移酶π（GST-π）在骨肉瘤组织中的表达，探讨其对骨肉瘤多药耐药的影响。 方法 收集武汉大学人民医院2009年1月～2017年6月33例骨肉瘤病理组织标本，应用免疫组化方法（Envision法）及Western blot法测定PIK3CA、GST-π在骨肉瘤标本中的表达。比较化疗耐药组（7例）和化疗有效组（26例）中表达的差异，并结合临床病理因素进行分析。 结果 免疫组化检测化疗耐药组和化疗有效组的PIK3CA表达的平均吸光度值分别为（11.089±2.147）、（6.938±2.065），差异有统计学意义（P < 0.05）；化疗耐药组和化疗有效组GST-π表达的平均吸光度值分别为（15.871±2.678）、（7.693±2.443），差异有统计学意义（P < 0.05）。Western blot法检测两组中PIK3CA和GST-π的蛋白表达，差异均有统计学意义（P < 0.05）。PIK3CA和GST-π在骨肉瘤组织中的蛋白表达具有相关性（r = 0.68，P < 0.01）。 结论 PIK3CA及GST-π在骨肉瘤化疗耐药组中高表达，且两者表达呈正相关，其可能是骨肉瘤耐药的发生机制之一。

[关键词] 骨肉瘤；磷脂酰肌醇3激酶；谷胱甘肽转移酶；多药耐药

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（a）-0021-04

[Abstract] Objective To detect the expression of phosphatidylinositol 3-kinase （PIK3CA） and glutathione-S transferase-π （GST-π） in osteosarcoma tissues and to explore its effect on the multidrug resistance of osteosarcoma. Methods Thirty-three cases of pathological tissue specimens of osteosarcoma from Renmin Hospital of Wuhan University from January 2009 to June 2017 were collected. The expression of PIK3CA and GST-π of 33 cases of osteosarcoma specimens was detected by immunohistochemistry （Envision method） and Western blot method. The differences between the chemotherapy-resistant group （7 cases） and the chemotherapy-effective group （26 cases） were compared. The results were analyzed combined with clinicopathological factors. Results The average optical density of PIK3CA in the chemotherapy-resistant group and chemotherapy-effective group was （11.089±2.147） and （6.938±2.065） respectively， and there was a significant difference between the two groups （P < 0.05）； the average optical density of GST-π in the chemotherapy-resistant group and chemotherapy-effective group was （15.871±2.678） and （7.693±2.443）， and there was a significant difference between the two groups （P < 0.05）. The average optical density of PIK3CA and GST-π by Western blot method had significant differences between the two groups （P < 0.05）. The expression of PIK3CA and GST-π in osteosarcoma was correlated （r = 0.68， P < 0.01）. Conclusion PIK3CA and GST-π are over expressed in osteosarcoma chemotherapy-resistant group， and the expression of PIK3CA and GST-π is positively correlated with each other， which may be one of the mechanisms of drug resistance in osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma； Phosphatidylinositol 3-kinase； Glutathione-S transferase； Multidrug resistance

骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤之一，其发病部位以股骨远端和胫骨近端最多见，发病年龄10～20岁占60%[1]。截肢术曾经是骨肉瘤的标准治疗术式，但术后患者5年生存率不足20%[2]。随着肿瘤化疗的发展，化疗联合保肢手术是新兴的治疗骨肉瘤的有效策略，可促使患者5年生存率提高近50%[3-4]。对于晚期患者，化疗是其主要治疗手段。然而有部分骨肉瘤患者因多药耐药（MDR）而对化疗不敏感，导致治疗失败，这是影响骨肉瘤患者愈后的主要原因之一[5]。因此近年来，关于骨肉瘤化疗耐药的机制及寻找逆转化疗耐药的新的靶点或药物，是骨肉瘤相关研究的热点和难点。细胞内解毒系统增加化疗药物的外排是骨肉瘤化疗耐药的主要机制之一。谷胱甘肽-S-转移酶π（glutathione-S-transferase-π，GST-π）是细胞内解毒系统的关键组成部分，也是目前已经证实的与MDR产生有密切关系的蛋白[6]。PI3K/AKT信號通路是近年来发现并证实在人类多种肿瘤的发生、生长及浸润过程中起了十分关键的作用的信号通路，其在多种肿瘤中激活，参与肿瘤细胞运动、抵抗凋亡等多个环节。PI3K/AKT信号转导通路中的Ⅰ类磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3Ks）的p110催化亚单位PI3Kp110α是该信号通路中的关键蛋白之一，其由PIK3CA基因编码。因此，PIK3CA也是近年来研究的热点基因。随着人们对PIK3CA基因及蛋白（PIK3Kp110α）的深入研究，发现其在肿瘤的多药耐药中可能也起到重要作用[7]。在大肠癌中，PIK3CA高表达与其耐药性相关。在骨肉瘤中，PIK3CA较正常组织高表达[8]，但其作用机制，特别是其与骨肉瘤化疗耐药的关系目前仍不明确。

本研究采用免疫组化Envision法和Western blot技术测定PIK3CA、GST-π在33例骨肉瘤组织中的表达，比较化疗耐药组和化疗有效组中表达的差异，并结合临床病理因素进行分析，旨在探讨骨肉瘤PIK3CA及GST-π表达与骨肉瘤化疗多药耐药的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取武汉大学人民医院2009年1月～2017年6月有化疗前明确组织学病理诊断及化疗后疗效评估的的骨肉瘤组织标本33例，其中男15例，女18例；年龄9～40岁，平均（18.7±4.6）岁；发病部位：股骨下端12例，胫骨上端9例，股骨上端4例，肱骨上端3例，股骨干3例，腓骨上端2例；Enneking分期：ⅡA期16例，ⅡB期6例，ⅢA期4例，Ⅳ期7例；8例为晚期姑息性化疗，25例为术前新辅助化疗，化疗采用MAID方案，具体方案如下：美司那1500 mg/m2 CIV第1～4天，阿霉素20 mg/m2 CIV第1～3天，异环磷酰胺2500 mg/m2 CIV第1～3天，达卡巴嗪 300 mg/m2 CIV第1～3天，每21天重复。新辅助化疗或姑息化疗2个周期后按RECIST标准行疗效评价。

1.2 化疗疗效评估和分组

该研究每位患者均有术前化疗的影像学基础评估，2个周期新辅助化疗或姑息化疗后，根据影像学变化（CT和/或MRI），选取目标病灶进行化疗疗效评价。化疗疗效评估标准采用欧洲肿瘤年会制订的关于实体肿瘤的疗效评价标准RECIST1.1版进行[9]。①完全缓解（CR）：所有目标病灶消失；②部分缓解（PR）：基线病灶长径总和缩小>30%；③疾病进展（PD）：基线病灶长径总和增加>20%或出现新病灶；④稳定（SD）：基线病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达PD[9]。化疗有效包括CR、PR及SD患者，化疗耐药指PD患者。据此疗效评价标准将33例患者分为化疗有效组（26例）和化疗耐药组（7例）。

1.3 试剂

兔抗人PI3Kinase p110α抗体浓缩液购自Cell Signaling Technology公司（工作浓度1∶100），鼠抗人GST-π单克隆抗体、通用型二抗以及其他辅助试剂均购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫组化检测 严格按照Max VisionTM法染色程序进行免疫组化步骤操作：首先二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，然后用3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，柠檬酸高压加热进行抗原修复，加一抗后4℃过夜，PBS冲洗后滴加二抗，室温孵育20 min，然后二氨基联苯胺（DAB）显色，脱水透明，中性树胶封片。PIK3CA蛋白以已知阳性表达的脑组织作阳性对照，GST-π用已知阳性的乳腺癌为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。Carestream软件显微镜采图后，用Imagepro图像分析软件检测平均吸光度值。

1.4.2 Western blot法检测 从骨肉瘤组织中提取总蛋白，每孔道加入50 μg蛋白，进行SDS-PAGE电泳，电泳电压100 V，共2～3 h電泳结束后进行PVDF膜转膜，转膜成功后置于5%脱脂奶粉封闭液中，37℃封闭2 h，然后用PBST洗膜后分别加入一抗PI3Kp110α和GST-π及β-actin，一抗按1∶10 000稀释，4℃过夜。第2天用PBS洗膜后加通用型二抗，均按1∶5000稀释，37℃孵育1 h，洗膜后ECL曝光，曝光后的胶片依次显影、定影，室温晾干、扫描，用Carestream软件显微镜采图后用Imagepro图像分析软件分析Western blot印迹结果中目的蛋白条带和相应内参条带的净吸光度值，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值作为目的蛋白的相对灰度值。

1.4.3 免疫组化结果判定 PIK3CA、GST-π阳性表达在胞质，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性标志，高倍镜下计数5个视野或1000个细胞，阳性细胞数≥10%为阳性，否则为阴性。同时用Carestream软件显微镜采图后，用Imagepro图像分析软件检测平均吸光度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验，PIK3CA和GST-π表达的相互关系用Pearson相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Envision法检测结果

化疗有效组PIK3CA和GST-π的平均吸光度值明显低于化疗耐药组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1（封三）、表1。

2.2 Western blot法检测结果

化疗有效组PIK3CA和GST-π蛋白表达的平均吸光度值明显低于化疗耐药组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表2。

2.3 PIK3CA和GST-π的相关性分析

经统计学分析，PIK3CA和GST-π在骨肉瘤组织中的表达呈正相关（r = 0.68，P < 0.01）。见表3。

3 讨论

骨肉瘤是发病率最高的原发骨恶性肿瘤，过去的主要治疗手段是采取截肢手术，然而术后患者容易发生复发转移，导致预后极差。近年来随着骨肉瘤化疗的发展，患者的总体预后得到了极大的改善，化疗联合手术成了目前的标准治疗模式。但有部分骨肉瘤患者存在MDR，这是导致肿瘤化疗失败的重要原因之一，并已经成为影响这部分骨肉瘤患者预后的重要因素。根据Krishna等曾作出的分类标准可将MDR分为两类——典型抗药机制与非典型抗药机制。典型机制中多药耐药相关蛋白及P-糖蛋白（P-gp）起主要抗药作用，在非典型机制中谷胱甘肽S-转移酶及拓扑异构酶等在多药耐药中起主要作用[10]。

GSTs是同源二聚体酶超基因家族的一种，有θ、μ、α、π等多种同工酶，其N端谷胱甘肽的结合位点含有酪氨酸残基，其羟基可以与硫醇化谷胱甘肽形成氢键，在催化反应中有重要作用，C端为亲电子结合区，为底物结合位点[11]。GST-π催化GSH的巯基能和多种体内或者体外来源的亲电化合物结合，结合后形成极性较大的复合物，这些复合物可以被多药耐药蛋白（MRP）和P-gp等泵出体外，从而实现GST-π的解毒作用。但同时，大多数化疗药物也可被GST-π催化和GSH结合形成GSH-药物复合物，同样易被MRP泵出体外，使抗肿瘤药物在体内作用时间变短，不能有效发挥作用，导致临床上发生严重的肿瘤细胞MDR[11-12]。GST-π除了通过直接的细胞解毒，还可以抑制凋亡的MARK通路，抑制肿瘤细胞凋亡而导致耐药[13]。本研究应用免疫组化法对骨肉瘤组织中GSTs的表达进行了测定，结果发现，在化疗耐药组中GSTs表达的吸光度值显著高于化疗有效组（P < 0.01）；同时采用Western blot方法检测了两组GSTs在骨肉瘤组织中的表达也得到同样结果，以上结果提示GSTs的表达与骨肉瘤化疗MDR有关，但GSTs表达的调节机制仍不明确。

PIK3CA基因定位于染色体3q26.3，长34 kb，其包含21个外显子。PIK3CA基因编码Ⅰ类磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3Ks）的p110催化亚单位，即PI3Kp110a。PI3Kp110a具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性，促使丝/苏氨酸蛋白激酶（AKT）活化，活化的AKT磷酸化多种底物参与调节细胞的增殖、凋亡、分化以及迁移等有关的信号通路，因此PI3K/AKT通路在细胞信号转导中发挥重要作用。PIK3CA的突变约4/5发生在螺旋区（exon9）和激酶区（exon20）这两个热点区域，其突变不仅可以减少细胞的凋亡，还可以促进肿瘤的浸润，提高其下游激酶PI3Ks的活性，及导致PI3K/Akt信号通路的激活[14-16]。PI3K/Akt信号通路作为细胞生长、增殖和抗凋亡的重要调节因素，近年来研究表明其与肿瘤耐药关系也十分密切[17-19]。张栋等[16]发现卵巢癌DDP耐药机制与PI3K/Akt信号通路异常有关，并且证实通过抑制PI3K/AKT信号通路能增强卵巢癌对DDP的敏感性。Wang等[7]发现，PI3K/AKT信号传导途径的激活使得结肠癌细胞对5-Fu的耐药性明显增加。Gobin等[20]发现，PI3K由于其突变频率高和/或其在癌细胞中的催化亚基功能增加，而成为骨肉瘤增殖转移的关键机制。但目前有关PIK3CA与骨肉瘤耐药关系研究极少，本研究以人骨肉瘤为研究对象，发现与化疗有效组相比，化疗耐药组细胞的PIK3CA的阳性表达吸光度值明显增高。另外，本研究发现，PIK3CA与GSTs的表达具有相关性，提示PIK3CA可能通过调控GSTs的表达影响骨肉瘤的化疗敏感性。

综上所述，在化疗耐药组中PIK3CA及GST-π阳性表达率明显高于化疗有效组，提示PIK3CA及GST-π可能参与骨肉瘤多药耐药过程。同時PIK3CA与GST-π的表达呈正相关，提示PIK3CA可能是人骨肉瘤GST-π介导的多药耐药的关键机制之一。本研究的不足之处在于，未进一步验证PIK3CA及GST-π对人骨肉瘤耐药的调控及机制。

[参考文献]

[1] Bousquet M，Noirot C，Accadbled F，et al. Whole-exome sequencing in osteosarcoma reveals important heterogeneity of genetic alterations [J]. Ann Oncol，2016，27（4）：738-744.

[2] Jiang F，Shi Y，Li GJ，et al. A meta analysis of limb salvage versus amputation in the treatment of patients with EnnekingⅡ pathologic fracture osteosarcoma [J]. Indian J Cancer，2015，2（6）：21-24.

[3] Chen R，Wang G，Zheng Y，et al. Long non-coding RNAs in osteosarcoma [J]. Oncotarget，2017，8（12）：20462-20475.

[4] 杜敏东，易生辉，秦刚，等.新辅助化疗结合保肢手术治疗骨肉瘤26例[J].中国医药导报，2017，14（29）：7-10.

[5] Jabeen S，Holmboe L，Andersen AM，et al. Impact of genetic variants of RFC1，DHFR and MTHFR in osteosarcoma patients treated with high-dose methotrexate [J]. Pharmacogenomics J，2015，15（5）：385-390.

[6] 邹翩，裴江鸿，石卫，等.基于GST-π的抗肿瘤药物研究进展[J].药学学报，2016，51（2）：241-247.

[7] Wang J，Wenjuan W，Cai H，et al. MACC1 facilitates chemoresistance and cancer stem cell like properties of colon cancer cells through the PI3K/AKT signaling pathway [J]. Mol Med Rep，2017，16（6）：8747-8754.

[8] He ML，Wu Y，Zhao JM，et al. PIK3CA and AKT gene polymorphisms in susceptibility to osteosarcoma in a Chinese population [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（9）：5117-5122.

[9] Eisenhauer EA，Therasse P，Bogaerts J，et al. New response evaluation criteria in solid tumours：revised RECIST guideline（version1.1）[J]. Eur J Cancer，2009，45（2）：228-247.

[10] Kirtane AR，Kalscheuer SM，Panyam J. Exploiting nanotechnology to overcome tumor drug resistance：challenges and opportunities [J]. Adv Drug Deliv Rev，2013， 65（13/14）：1731-1747.

[11] Ebeed SA，Sadek NA，Zaher ER，et al. Role of MRP-1 and GST-Pi in MDR and their inhibition by indomethacin in AML [J]. Alexandria Journal of Medicine，2017，53（3）：251-259.

[12] 杨艳，杜云翔，张闯，等.p63、P-gp、GST-π及Topo-Ⅱ在食管鳞癌组织中的表达[J].东南大学学报，2016，35（6）：927-931.

[13] Di-Pietro G，Magno LA，Rios-Santos F. Glutathione S-transferases：an overview in cancer research [J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol，2010，6（2）：153-170.

[14] 翟墨.新輔助化疗联合保肢手术治疗骨肉瘤的临床研究[J].中国现代医生，2016，54（1）：58-61.

[15] 沈志华，郭菁菁.黄芩苷对人骨肉瘤MG63细胞凋亡及MMPs表达的影响[J].中国药房，2016，27（4）：488-490.

[16] 张栋，孔德璇，和珍珍，等.PI3K/AKT信号转导通路与卵巢癌顺铂耐药相关性的研究[J].天津医药，2011，39（4）：361-363.

[17] Nakayama I，Shinozaki E，Matsushima T，et al. Retrospective study of RAS/PIK3CA/BRAF tumor mutations as predictors of response to first-line chemotherapy with bevacizumab in metastatic colorectal cancer patients [J]. BMC Cancer，2017，17（1）：38.

[18] 蔡奋忠，林雄哲.胶质瘤PI3K/AKT/mTOR信号通路靶向治疗研究进展[J].中国现代医生，2016，54（30）：165-168.

[19] 贾成舒，王均伟，李慧，等.PI3K抑制剂与其他药物联用克服耐药性的研究进展[J].中国医药大学学报，2017， 48（5）：523-528.

[20] Gobin B，Huin MB，Lamoureux F，et al. BYL719，a new alpha-specific PI3K inhibitor：single administration and in combination with conventional chemotherapy for the treatment of osteosarcoma [J]. Int J Cancer，2015，136（4）：784-796.