骨性关节炎中lncRNA MEG3的表达及其与VEGF的相关性分析

刘振峰 梁治权 邓迎杰 方锐 孟庆才

[摘要] 目的 檢测长链非编码RNA母系表达基因3（lncRNA MEG3）和血管内皮生长因子（VEGF）在骨性关节炎（OA）软骨组织中的表达情况，并分析lncRNA MEG3表达与VEGF表达之间的相关性。 方法 2014年1月～2015年12月，收集新疆维吾尔自治区中医医院40例原发性OA患者和20例志愿者的正常膝关节软骨组织；番红O对软骨组织进行染色后，改良Mankin评分标准对OA患者进行分组；实时定量荧光PCR试验检测各膝关节软骨组织中lncRNA MEG3和VEGF mRNA表达水平，酶联免疫吸附测定（ELISA）试验检测VEGF蛋白水平。Pearson相关系数法分析lncRNA MEG3表达与VEGF表达之间的相关性。 结果 Real-time PCR结果显示，与正常软骨组织相比，lncRNA MEG3在OA患者软骨组织中相对表达量显著降低（P < 0.05），且软骨退化程度越高，lncRNA MEG3相对表达量越低（P < 0.05）。VEGF mRNA和VEGF蛋白相对表达量在OA患者软骨组织中均显著高于正常软骨组织（P < 0.05），且软骨退化程度越高，VEGF mRNA和VEGF蛋白相对表达量越高（P < 0.05）。Pearson相关分析结果显示，lncRNA MEG3表达与VEGF表达之间呈负相关（r = -0.466，P < 0.05）。 结论 lncRNA MEG3在OA软骨组织中低表达，且与VEGF表达之间呈负相关，提示lncRNA MEG可能通过调节血管生成参与原发性OA的发生过程。

[关键词] 骨性关节炎；长链非编码RNA母系表达基因3；血管内皮生长因子；相关性

[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（a）-0008-05

[Abstract] Objective To determine the expressions of long non-coding RNA MEG3 （lncRNA MEG3） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in the articular cartilage tissues of osteoarthritis （OA）， and to analyze the correlation between the lncRNA MEG3 and VEGF. Methods The knee articular cartilage tissues from 40 cases of primary OA and 20 healthy volunteers were collected from January 2014 to December 2015 in Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region. After the safranin O staining， the OA patients were grouped according to the improved score criterion of Mankin. Real-time PCR assay was applied to detect the expressions of lncRNA MEG3 and VEGF mRNA in the knee articular cartilage tissues， and the ELISA assay was utilized to determine the protein level of VEGF. The correlation between the lncRNA MEG3 and VEGF was analyzed by the Pearson. Results The real-time PCR results showed that compared to the normal articular cartilage tissues， the lncRNA MEG3 was significantly downregulated in the OA articular cartilage tissues （P < 0.05）， and the higher degree of degradation， the lower of lncRNA MEG3 （P < 0.05）. Moreover， the mRNA and protein levels of VEGF were significantly upregulated in the OA articular cartilage tissues （P < 0.05）， and the higher degree of degradation， the higher of VEGF （P < 0.05）. The Pearson results showed that there was a negative relationship between the lncRNA MEG3 and VEGF （r = -0.466， P < 0.05）. Conclusion lncRNA MEG3 was decreased in the articular cartilage tissues of OA， and lncRNA MEG3 was negatively correlated with the VEGF. lncRNA MEG3 may be involved in primary OA development through the regulation of angiogenesis.

[Key words] Knee osteoarthritis； Long non-coding RNA MEG3； Vascular endothelial grouth factor； Correlation

据调查统计发现，约50%的65岁以上老年人患有骨关节炎（OA），其中以原发性膝关节性OA最常见[1]。在中国，随着人口老龄化的加剧，OA逐渐成为一个主要的公共健康问题。迄今为止，OA的发病机制并未完全阐明，缺乏确切的有效治疗方法。因此，寻找能够预防OA发生、指导治疗方案选择和减轻OA症状的新生物靶标，是临床亟需解决的问题。目前，公认与OA发生密切相关的两大因素是炎症和血管生成，靶向滑膜血管生成可能成为减轻疾病症状、OA治疗方案选择的研究方向[2]。

非编码RNA（ncRNA）是一类不具有蛋白编码的能力的RNA分子[3]。根据分子大小，ncRNA可分为两大类，即微小RNA（microRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）[4-5]。研究表明，microRNA在OA发生和进展中存在异常表达，且影响软骨的完整性[6]；此外，已有研究证实，lncRNA在骨和软骨发育过程中发挥重要作用[7]。lncRNA具有作为OA疾病诊断和治疗分子靶标的潜能[8]。MEG3基因位于染色质14q32.3，属于抑癌基因[9]，其转录产物为lncRNA。lncRNA MEG3可能通过抑制血管生成，阻碍肿瘤恶性进展[10]。而关于lncRNA MEG3在OA发生和进展中的作用，相关研究甚少。本研究检测原发性膝关节性OA患者和健康志愿者软骨组织中lncRNA MEG3表达情况，并分析lncRNA MEG3表达与VEGF表达之间的关系，以期为OA临床治疗提供理论基础。

1资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月～2015年12月在新疆维吾尔自治区中医医院（以下简称“我院”）住院部确诊为原发性膝关节性OA，且行人工全膝关节置换术或关节清理术的40例患者自愿捐赠的软骨组织，其中男21例，女19例；年龄50～78岁，平均（59.43±8.32）岁；左侧27例，右侧13例。诊断标准：根据中华医学会制订的《骨关节炎诊治指南（2007年版）》[11]中膝关节性OA的诊断标准，即膝关节疼痛、发僵、关节活动明显受限；反复劳损或创伤史；膝关节屈伸活动时，可扪及摩擦音；膝关节正、侧位照片，显示髌骨、股骨髁、胫骨平台关节缘呈唇样骨质增生，胫骨髁间隆起变尖，关节间隙变窄。纳入标准：原发性OA并行膝关节置换者；近6个月无服用抗炎药物、激素等。排除标准：服用免疫抑制剂等；既往有膝关节手术史；创伤性关节炎、化脓性关节炎和类风湿关节炎等其他类型的关节炎。取同期20例创伤后行截肢术、膝关节内游离软骨块行关节镜取出术患者自愿捐赠的正常膝关节软骨组织作为对照，其中男13例，女7例；年龄50～71岁，平均（58.68±9.45）岁；左侧9例，右侧11例。对照组纳入标准：既往无关节疼痛、僵硬肿胀及活动受限的病史；患者及其家族中均无骨、关节代谢性疾病病史；膝关节的影像学检查无异常；术中对关节软骨进行大体观察排除退行性改变并且评分为正常。两组患者在年龄、性别方面比较，差异无统计学意义（t = 0.315， χ2=0.848， P < 0.05）。将所获得软骨组织分成两份：一份置于中性甲醛内，用于组织学检查；另一份取出后立即置于液氮中保存，用于分子生物学检测。所有患者均具有完整的病历资料，签署知情同意书，本研究经我院伦理委员会审核同意。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂与仪器 番红O溶液购自北京雷根生物技术有限公司，Trizol试剂、RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒均购自美国Invitrogen公司，real-time PCR引物购自上海生工生物工程股份有限公司，酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司。

超微量核酸蛋白测定仪（ND2000，美国Thermo公司）、定量PCR扩增仪（7500，美国ABI公司）、酶标仪（ELX800，美国Bio-Tek仪器有限公司）。

1.2.2 组织学染色及改良Mankin關节软骨病理评分 所有软骨组织样本经中性甲醛固定后，石蜡包埋，5 μm厚切片；经二甲苯脱蜡，在100%、95%、90%、80%的乙醇中浸泡各3～5 min，再放入蒸馏水中3 min；新鲜配制的Weigert染液染色5 min，酸性酒精（1%盐酸，70%乙醇）中使之分化15 s，蒸馏水冲洗3 min；0.02%碱性孔雀绿水溶液中染色3 min，1%的醋酸中快速漂洗；0.1%的番红O水溶液中染色1 min，95%乙醇冲洗。脱水，清理，封片。

每个样本随机选取10个视野，高倍显微镜下进行观察，按照改良Mankin病理评分标准对关节软骨病理程度进行评分，该评分范围为0～14分，分组标准如下，正常组：0～1分；轻度退变组：2～5分；中度退变组：6～9分；重度退变组：10～14分。分值越大代表关节退变越严重。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测lncRNA MEG3和VEGF mRNA相对表达量 Trizol法提取软骨组织的总RNA，按照RNA提取试剂盒的说明书操作。超微量核酸蛋白测定仪检测总RNA浓度及纯度，逆转录试剂盒进行逆转录，cDNA产物置于-20℃保存备用。实时荧光定量PCR（Real-time PCR）引物序列如下，lncRNA MEG3正向引物5'-3'：CTG CCC ATC TAC ACC TCA CG，反向引物5'-3'：CTC TCC GCC GTC TGC GCT AGG GGC T；VEGF正向引物5'-3'：CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT，反向引物5'-3'：AGC AAG GCC CAC AGG GAT TT；GAPDH正向引物5'-3'：GAA GGT GAA GGT CGG AGT CA，反向引物5'-3'：GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC。定量PCR扩增仪检测lncRNA MEG3表达水平。Real-time PCR扩增体系为20 μL，反应体系：ddH2O，6 μL；SYBR Green Master Mix，10 μL；正向引物，1 μL；反向引物，1 μL；cDNA，2 μL。反应条件：50℃预热2 min，95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸55 s，进行35个循环。采用2-ΔΔCt方法表示lncRNA MEG3和VEGF mRNA的相对表达量。

1.2.4 ELISA法检测VEGF蛋白表达 取100 mg液氮保存的软骨组织，置于经液氮预冷不锈钢管；用钢制小锤在液氮中将组织标本击碎，研磨至粉状。粉末置于溶液中（150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris HCl buffer，pH7.4），充分溶解后，48 000 g，4℃，离心60 min，取上清，VEGF的ELISA试剂盒进行检测，实验重复3次后，进行统计分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨组织的Mankin评分和分组

采用番红O溶液对软骨组织进行染色，改良的Mankin评分标准对OA关节软骨进行分组，结果显示，本研究中40例OA患者分为轻度退变组11例，中度退变组18例和重度退变组11例。组间Mankin评分比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 lncRNA MEG3在OA软骨组织中的表达情况

lncRNA MEG3在OA软骨组织中的相对表达量显著低于正常膝关节软骨组织，而且随着OA软骨退化程度的提高，lncRNA MEG3的表达含量逐步降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 VEGF表达在OA软骨组织中的表达情况

Real-time和ELISA试验结果显示，VEGF mRNA和VEGF蛋白在OA软骨组织中的相对表达量均显著高于正常软骨组织，且随着OA软骨退化程度的提高，VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达含量逐步增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.4 lncRNA MEG3表达与VEGF表达的相关性

Pearson相关系数分析结果显示，在OA软骨组织中，lncRNA MEG3表达与VEGF表达之间存在线性相关（r = -0.466，P = 0.002）。见图1。

3 讨论

膝关节是人体最复杂、活动最频繁的骨骼结构，其骨端覆盖一层厚1～5 mm的关节软骨，由软骨细胞、纤维和基质组织构成，关节软骨中缺少血液和淋巴供应，主要由关节腔内的关节液体提供养分。膝关节性OA最主要的改变是关节软骨的退化，这也是造成关节疼痛的主要原因[1-2]。

近年来，在OA的病因、发病机制和治疗等方面的研究取得了较大进展，但目前OA的治疗以保守治疗为主，如使用非甾体抗炎药（NSAIDs）止痛，康复训练来改善关节功能，待病情发展至晚期，则只能通过人工关节置换[12]。晚期OA患者大多伴有糖尿病、高血压等心脑血管疾病，关节置换手术风险大，并发症发生率高，且费用昂贵。因此，阐明OA发病机制，寻找能够延缓软骨退变的方法，是临床亟需解决的问题。

MEG3是一种印迹基因，定位于染色质14q32.3，其转录产物为lncRNA，而并非蛋白质。MEG3基因在人类多种组织中表达，可在卵巢、乳腺、胰腺和肝脏等组织中检测到MEG3基因转录产物，而MEG3在胎盘、脑和腺垂体中高表达。目前发现的MEG3转录本共有27个，Zhang等[13]在人胎儿肝cDNA文库筛选出了多个MEG3亚型基因，并且发现这些MEG3亚型基因有相同的功能，如刺激p53介导的激活能力，抑制肿瘤生长等，提示MEG3亚型基因具有相似功能。因此，本研究采用能够检测所有MEG3剪切体的引物，检测MEG3在OA软骨组织中的表达水平。

研究發现，在多种类型的人类肿瘤细胞中都存在MEG3基因表达缺失，提示MEG3具有作为抑癌基因的能力，MEG3基因表达缺失对肿瘤形成和恶性进展起促进作用。外源性增加MEG3基因表达，显著抑制了肿瘤细胞的集落形成和锚定非依赖型生长能力[14]，证实MEG3能够抑制肿瘤细胞的增殖。

目前，关于lncRNA MEG3在OA疾病发生和软骨退变中的功能的研究甚少。本研究发现，在OA软骨组织中，lncRNA MEG3表达下降，且随着OA严重程度的提高，lncRNA MEG3的表达含量逐步降低，提示MEG3表达丢失可能促进了OA发生和进展。

此外，Gordon等[10]在MEG-null小鼠脑组织中发现，与血管生成途径相关基因的表达增加，血管内皮生长因子α（VEGFA）及其Ⅰ型受体（VEGFR1）表达显著增加，提示敲除MEG3基因可能促进了血管生成。VEGFA和VEGFR1是血管生成的主要调节剂，同时新的血管生成是诱发OA所必需的。因此，MEG3失活导致的血管生成可能是其促使OA进展的机制之一。

有研究结果提示，血管生成是导致关节软骨损伤，诱发OA的关键因素[15]。VEGF具有调节肥大软骨重塑、骨化和生长板软骨血管侵袭的作用[16]。正常软骨中无血管，而血管侵袭至软骨，是骨化的第一个关键步骤，并且脉管系统为募集参与软骨吸收和骨沉积相关细胞提供了通道[17]。

为了检测在OA中MEG3和VEGF表达之间的关系，本研究采用Real-time PCR和ELISA试验检测VEGF的表达水平。与正常软骨组织相比，VEGF mRNA和VEGF蛋白在OA软骨组织中表达显著增加，且随着OA软骨退化程度的提高，VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达含量逐步增加，提示VEGF可能通过促进软骨血管生成从而促进OA进展。

本研究进一步分析了OA软骨组织中，lncRNA MEG3表达与VEGF表达之间是否具有相关性。Pearson线性分析结果显示，lncRNA MEG3与VEGF之间呈负相关，提示MEG3失活，增强的血管生成，是促进OA进展的机制之一。

而MEG抑制血管生成的具体机制尚不明确。有研究显示lncRNA MEG3能够激活p53介导的转录激活[18-19]。p53能够通过结合至VEGF启动子区的转录因子Sp1负调控VEGF转录[20]。因此，lncRNA MEG3表达丢失，可能导致了p53活性降低，进而增强了VEGF转录。以上结果提示，MEG3可能是通过p53通路介导的血管生成抑制作用，以及抑制VEGF表达。也有研究提示，lncRNA MEG3可通过非依赖p53的通路发挥作用[21]，本研究将在后续研究中对lncRNA MEG3调节VEGF表达的具体机制进行深入探讨。

综上所述，本研究结果提示，lncRNA MEG3在原发性OA软骨组织中表达显著下降，且lncRNA MEG3表达与VEGF表达之间负相关，提示lncRNA MEG3参与原发性OA的发生过程，可能是通过调节血管生成实现的。

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