基于分子对接技术的金莲花主要成分抗病毒和抗炎机制预测

方明月 李德利 刘双月 王青青 赓迪 马超 王如峰

摘要：目的 利用分子对接技术预测金莲花中牡荆素、荭草素、牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2"-O- β-L-半乳糖苷、藜芦酸、金莲花碱的抗病毒和抗炎机制。方法 运用Discovery Studio 2.5软件和药物化学数据库，将金莲花的6个活性成分与Toll样受体蛋白（TLRs）及神经氨酸酶（NA）靶点进行分子对接，通过模拟运算，分析对接结果及其功能区域的相互作用关系。结果 牡荆素、荭草素、牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷、藜芦酸、金莲花碱均作用于1种或多种TLR，而荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷与3种TLR均无相互作用；黄酮类化合物，即牡荆素、荭草素、牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷均可与NA结合，而藜芦酸和金莲花碱与NA无相互作用。结论 金莲花的6个活性成分中，5个成分可影响TLRs介导的信号通路，TLR3、4、7是其抗病毒抗炎作用的潜在靶点；4个黄酮类化合物可通过作用于NA而影响流感病毒活性。本研究可为探讨金莲花的抗病毒和抗炎有效成分及其进一步开发利用提供依据。

关键词：金莲花；分子对接；Toll样受体蛋白；神经氨酸酶；抗病毒；抗炎

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）07-0057-05

Abstract： Objective To predict the antiviral and anti-inflammatory mechanisms of major compounds from the flowers of Trollius chinensis， namely， vitexin， orientin， 2”-O-β-L-galactopyranosylvitexin， 2”-O-β-L-galactopyranosylorientin， veratric acid， and trolline， by using the molecular docking technique. Methods Discovery Studio 2.5 software and Chinese Medicine Chemistry Database were employed for docking between the ligands including 6 compounds and the proteins including Toll-like receptors （TLRs） and neuraminidase （NA）. The docking results and interactions of their functional domains were obtained by simulation analysis. Results Vitexin， orientin， 2”-O-β-L-galactopyranosylvitexin， veratric acid， and trolline were applied to one or more TLR， whereas 2”-O-β-L-galactopyranosylorientin could interact with neither of the proteins investigated. Flavonoids， namely vitexin， orientin， 2”-O-β-L-galactopyranosylvitexin and 2”-O-β-L-galactopyranosylorientin were applied to NA， whereas veratric acid and trolline could not interact with NA. Conclusion Five out of the 6 compounds have influence on the signaling pathways mediated by TLRs， and TLR3， 4， and 7 are their potential targets for antivirus and anti-inflammation. Four flavonoids can affect the activity of influenza virus by interacting with NA. This study can provide a basis for the investigation of the antiviral and anti-inflammatory effective compounds of the flowers of Trollius chinensis and the further development.

Keywords： Trollius chinensis； molecular docking； Toll-like receptors； neuraminidase； antiviral； anti-inflammatory

金蓮花为毛茛科植物金莲花Trollius chinensis Bge.的干燥花[1]，功效清热解毒、利咽消肿，临床用于治疗上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎、急性中耳炎等疾病[2]。金莲花中黄酮类成分含量最高，约占干重的16%，牡荆素、荭草素，牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷为其重要的黄酮类成分。酚酸类化合物的含量在金莲花中居第2位，包括藜芦酸、金莲花苷、原金莲酸等，而生物碱类是其中含量较少的一类成分，目前主要发现了金莲花碱[3-5]。药理研究表明，金莲花及其主要成分具有抗病毒、抗炎、抗菌等生物活性，但其抗病毒和抗炎机制尚不明确[6-8]。

Toll样受体蛋白（TLRs）通过胞外区感应组织中的危险信号，经相应的接头蛋白进行信号传导，激活相关的核内基因，从而诱导感染性炎症和非感染性炎症的产生[9-10]。神经氨酸酶（NA）是一种流感病毒糖蛋白，能催化水解唾液酸末端的N-乙酰基神经氨酸与邻近寡糖D-半乳糖或D-氨基半乳糖之间的α（2，6）或α（2，3）糖苷键，使成熟的病毒颗粒最终脱离宿主细胞，感染新的上皮细胞，造成流感病毒在患者体内的扩散[11]。

近年来，计算机辅助药物设计方法得到迅速发展，为合理设计新药物提供了一定的理论指导。分子对接技术是计算机辅助药物设计的重要组成部分，已成为作用机制预测和活性虚拟筛选的新兴工具[12-15]。通过计算机模拟药物分子产生药效反应的过程，发现与药物分子相互结合、产生相互作用的靶蛋白。通过分子对接技术，可确定复合物中靶点与配体正确的相对位置和取向，了解两者的相互作用，预测药物作用机制并提供新药设计的基础[16-17]。本研究利用分子对接技术，对金莲花中6种主要成分进行抗病毒和抗炎机制预测。

1 材料

Discovery Studio 2.5软件为网络免费授权软件，运行于Localhost（Windows32）操作系统。TLR3、TLR4、TLR7、NA的结构信息来源于蛋白数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）。化合物的三维结构信息来源于PubMed数据库（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）。

2 方法与结果

2.1 结构预处理

在蛋白数据库中搜索并下载TLR3、TLR4、TLR7、NA蛋白晶体结构文件。TLR3为人源，其蛋白编号为1ZIW；TLR4为鼠源，其蛋白编号为5IJB；TLR7为猴源，其蛋白编号为5GMF；NA来源于乙型流感病毒，其蛋白编号为1A4G。利用分子对接软件，去除蛋白晶体结构中的相关配体，并对蛋白进行前处理，得到用于对接的洁净蛋白结构并保存[18]。在PubMed数据库中查找并下载牡荆素（编号CID5280441）、荭草素（编号CID5281675）、牡荆素- 2"-O-β-L-半乳糖苷（编号CID44257714）、荭草素- 2"-O-β-L-半乳糖苷（编号CID44257952）、藜芦酸（编号CID7121）、金莲花碱（编号CID11160309）的三维分子结构，进行能量优化并保存[19-20]。

2.2 蛋白前处理

TLR3：根据文献[21]，以白藜芦醇作为阳性药确定活性位点，均方根偏差（RMSD）<2，确定蛋白活性口袋，结果见图1a。TLR4：在DrugBank数据库中以TLR4为关键词搜索，获得6种阳性药物，分别为（R）-3-羟基十四烷酸（编号DB02767）、eritoran tetrasodium（编号DB04933）、golotimod（编号DB05475）、月桂酸（编号DB03017）、豆蔻酸（编号DB08231）、纳洛酮（编号DB01183）；以这6种阳性药物确定活性位点，RMSD均小于2，以纳洛酮确定蛋白活性口袋，结果见图1b。TLR7：在DrugBank数据库中以TLR7为关键词搜索，获得4种阳性药物，分别为golotimod（编号DB05475）、羟基氯喹（编号DB01611）、咪喹莫特（编号DB00724）、艾沙托立宾（编号DB04860）；以这4种阳性药物确定活性位点，RMSD均小于2，以咪喹莫特确定蛋白活性口袋，结果见图1c。NA：根据文献[22]，以扎那米韦作为阳性药确定活性位点，RMSD<2，确定蛋白活性口袋，结果见图1d。

注：a.TLR3；b.TLR4；c.TLR7；d.NA

图1 TLR3、4、7及NA的活性口袋设置

2.3 分子对接

使用Libdock程序进行分子对接。在参数设置过程中，将参数“Conformation Method”确定为BEST，其他参数采用软件的默认设置[23]。经过Discovery Studio 2.5软件运算分析，得到金莲花中6种化合物牡荆素、荭草素、牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、藜芦酸、金莲花碱分别与TLR3、TLR4、TLR7、NA蛋白的對接信息。

2.3.1 Toll样受体蛋白3

以白藜芦醇作为阳性药确定活性位点，RMSD<2，白藜芦醇的打分值为95.490 9。以该数值的80%作为截断值，即76.390 0。牡荆素、荭草素、藜芦酸、金莲花碱的打分值均高于76.390 0。化合物与TLR3结合的空间位置以及对接打分值见表1。

2.3.2 Toll样受体蛋白4

以TLR4作为关键词搜索DrugBank数据库，获得6种阳性药物。以这6种阳性药物确定活性位点，RMSD均小于2。阳性药物纳洛酮、Eritoran tetrasodium、golotimod、月桂酸、（R）-3-羟基十四烷酸、豆蔻酸的打分值分别为67.813 1、179.073 0、105.642 0、98.879 9、108.439 0、100.844 0。以阳性药物中打分值最低的纳洛酮的80%作为截断值，即54.250 0。牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷、藜芦酸、金莲花碱的打分值均高于54.250 0。化合物与TLR4结合的空间位置以及对接打分值见表2。

2.3.3 Toll样受体蛋白7

以TLR7作为关键词搜索DrugBank数据库，获得4种阳性药物。以这4种阳性药物确定活性位点，RMSD均小于2。阳性药物咪喹莫特、羟基氯喹、艾沙托立宾、golotimod的打分值分别为89.812 6、104.584 0、116.549 0、126.082 0。以阳性药物中打分值最低的咪喹莫特的80%作为截断值，即71.850 0。牡荆素、荭草素、藜芦酸、金莲花碱、牡荆素-2"- O-β-L-半乳糖苷打分值均高于71.850 0。化合物与TLR7结合的空间位置以及对接打分值见表3。

2.3.4 神经氨酸酶

以扎那米韦作为阳性药确定活性位点，RMSD<2，白藜芦醇的打分值为121.087 0。以该数值的80%作为截断值，即96.869 6。牡荆素、荭草素、牡荆素- 2"-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷的打分值均高于96.869 6。化合物与NA结合的空间位置以及对接打分值见表4。

3 讨论

TLRs是机体免疫系统识别感知细菌、病毒等病原体入侵的重要分子，在机体免疫防御功能中发挥着重要作用，因此相关作用机制的研究倍受关注。在TLRs的信号传导中，TLR4和TLR7通过髓样分化因子88（MyD88）依赖途径即MyD88/IRAK/TRAF6的信号传递活化转化生长因子激活激酶1（TAK1）和核因子-κB （NF-κB）信号通路，促进炎性因子等相关基因表达；TLR3和TLR4可通过MyD88非依赖途径，即通过接头分子TRIF或TRAM，最终引起NF-κB的活化和干扰素调节因子3（IRF3）的核转位，调控炎性因子和干扰素的表达[24-26]。由对接结果可知，与TLR3、4、7对接打分值大于阳性药物打分值80%的化合物分别有4、3、5个。与TLR3结合活性由大到小依次为：牡荆素>荭草素>金莲花碱>藜芦酸；与TLR4结合活性由大到小依次为：牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷>藜芦酸>金莲花碱；与TLR7结合活性由大到小依次为：牡荆素>荭草素>牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷>金莲花碱>藜芦酸。与3个靶点蛋白都有较高结合活性的化合物有2个，分别是藜芦酸和金莲花碱。金莲花中的黄酮类（牡荆素、荭草素）、酚酸类（金莲花苷、藜芦酸）和生物碱类（金莲花碱）都具有抗病毒和抗炎活性[5]，与梁经纬等[17]研究发现金莲花碱具有抗菌作用的结果一致。根据本研究结果推测，这些化合物通过影响TLR3/4/7介导的信号通路发挥作用，TLR3、4、7可能是牡荆素、荭草素、牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷、金莲花碱、藜芦酸抗病毒和抗炎作用的潜在靶点，而荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷与上述3种蛋白均无相互作用，初步推測其对TLRs介导的信号通路无影响[8，27]。

NA在病毒的复制和致病过程中起重要作用，神经氨酸酶抑制剂的研究与开发已成为寻找治疗流感病毒药物的研究热点[28]。靳玉瑞等[29]提出黄酮类化合物对NA具有很好的抑制作用，分子模拟对接结果显示，6个化合物中的4个黄酮类化合物（牡荆素、荭草素、牡荆素-2"-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷）均可与NA结合，并与阳性药扎那米韦的作用位点接近，可初步推测其对NA具有抑制活性，可作为抗流感病毒的潜在药物。酚酸类（金莲花苷和藜芦酸）和生物碱类（金莲花碱）与NA无相互作用，初步推测其不影响流感病毒中的NA的作用。

目前金莲花抗病毒和抗炎机制尚不明确。本研究以多个靶点对金莲花中6种成分进行筛选，结果显示，金莲花不但存在单个成分与多个靶点的作用，而且存在不同成分与同一靶点的作用，表明金莲花抗炎和抗病毒作用可能涉及多成分、多靶点、多通路之间的协同作用。本研究可以深化对金莲花主要化学成分生物活性的认识，为探讨金莲花的抗病毒和抗炎有效成分及其作用机制提供依据。但本研究结果仅是根据这些化合物结构进行预测得出的，需要通过体内外实验对其抗病毒和抗炎活性和机制进一步验证。

参考文献：

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：人民卫生出版社，1977：359.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986：1398.

[3] 王如峰，马群，杨继锋.HPLC测定金莲花中金莲花碱的含量[J].中国中药杂志，2012，37（2）：247-249.

[4] WANG R F， MA C M， YANG X W， et al. A bioactive alkaloid from the flowers of Trollius chinensis[J]. Heterocycles，2004，63（6）：1443-1148.

[5] 王如峰，赓迪，吴秀稳，等.金莲花中四种主要成分的抗炎活性研究[J].时珍国医国药，2012，23（9）：2115-2116.

[6] 北京制药厂.金莲花的药理实验和临床观察报告[J].新医药学杂志， 1973（5）：31-34.

[7] 刘一杰，薛永常.植物黄酮类化合物的研究进展[J].中国生物工程杂志，2016，36（9）：81-86.

[8] 曹欣欣，王书华.牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用及其机制研究[D].张家口：河北北方学院，2016.

[9] 孙文超，汪伟，易驰喆，等.山羊Toll样受体基因TLR2和TLR4及TLR9的荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2018，48（3）：323- 328.

[10] 贾辅忠，李兰娟.感染病学[M].南京：江苏科学技术出版社，2010：31.

[11] 武广华，臧益秀，刘运祥，等.中国卫生管理辞典[M].北京：中国科学技术出版社，2001：422.

[12] 刘景陶，刘映雪.计算机辅助药物设计在分子对接中的应用[J].科技创新与应用，2016（34）：67.

[13] 韩彦琪，许浚，刘昌孝，等.基于网络药理学的元胡止痛滴丸治疗原发性痛经的作用机制研究[J].药学学报，2016，51（3）：380-387.

[14] WANG S Q， DU Q S， CHOU K C. Study of drug resistance of chicken influenza A virus （H5N1） from homology-modeled 3D structures of neuraminidases[J]. Biochem Biophys Res Commun，2007，354（3）：634-640.

[15] WANG S Q， DU Q S， HUANG R B， et al. Insights from investigating the interaction of oseltamivir （Tamiflu） with neuraminidase of the 2009 H1N1 swine flu virus[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2009，386（3）：432-436.

[16] WADOOD A， RIAZ M， JAMAL S B， et al. Molecular docking study of P4-benzoxaborole-substituted ligands as inhibitors of HCV NS3/4A protease[J]. Bioinformation，2003，9（6）：309-314.

[17] 梁經纬，孙琦，赵楠，等.金莲花碱的潜在作用靶标预测及分子对接研究[J].计算机与应用化学，2016，33（7）：800-802.

[18] 李洋，夏厚林，周厚琴，等.基于分子对接技术预测人面子叶中黄酮成分抗菌作用靶点[J].中国医院用药评价与分析，2016，16（10）：1303- 1307.

[19] 齐燕姣，陆会宁，金能智.血清白蛋白与抗肿瘤药物莪术醇的相互作用关系[J].生物信息学，2017，15（1）：59-68.

[20] 李娜，张新庄，王俨如，等.基于网络药理学方法探讨通塞脉片治疗动脉粥样硬化的作用机制[J].中国中药杂志，2016，41（9）：1706-1712.

[21] 李佳曦.金欣口服液及白藜芦醇对RSV活化诱导的TLR3及其信号通路的调控作用[D].南京：南京中医药大学，2012.

[22] 史海龙，李军，魏敏慧，等.传统中药中H7N9病毒神经氨酸酶抑制剂的计算机虚拟筛选[J].时珍国医国药，2016，27（3）：762-765.

[23] 胡衍保，彭静波，顾硕，等.复方心可舒治疗冠心病多靶点作用的分子对接[J].物理化学学报，2012，28（5）：1257-1264.

[24] 程魁，朱海亮，赵劲，等.免疫蛋白TLR3和4的抑制剂的设计、合成、结构修饰及信号传导研究[D].南京：南京大学，2011.

[25] 王金兰，尹德领.脊椎动物Toll样受体识别多样病原体机制研究[D].济南：山东大学，2016.

[26] QI S G， YU H， WANG Z L， et al. Three-dimensional common-feature hypotheses for Toll-like receptor 7 agonists[J]. J Chin Pharm Sci， 2013，22：148-153.

[27] 王树林，安芳.荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用及其机制研究[D].张家口：河北北方学院，2016.

[28] CALFEE D P， HAYDEN F G. New approaches to influenza chemotherapy. Neuraminidase inhibitors[J]. Drugs，1998，56（4）：537-553.

[29] 靳玉瑞，李爱秀，邓联柏.黄酮类化合物的神经氨酸酶抑制活性及构效关系研究进展[J].中国新药杂志，2012，21（19）：2272-2277.

（收稿日期：2017-09-19）

（修回日期：2017-12-04；编辑：陈静）