大黄素对脓毒症大鼠凝血紊乱治疗的作用

林青伟，宋景春，曾庆波，钟林翠，宋晓敏，张 昕

0 引 言

脓毒症是国际性的医学难题，具有高发病率、高病死率的特点[1]；且目前全球脓毒症的年患病人数仍在增加[2]。脓毒症患者一旦发展为重症脓毒症和脓毒性休克，病死率可分别高达25%～30% 和40%～70%。据统计，脓毒症合并凝血功能障碍的患者占脓毒症总数的80%以上，病死率则更高[3]。

大黄素别名为朱砂莲甲素，主要提取自中药大黄的根茎，化学名为1,3,8-三羟基-6 甲基蒽醌( 1，3，8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone)，相对分子质量为270.23，呈三环平面结构，是分布最广泛的一种羟基蒽醌类化合物。祖国医学认为中药大黄具有泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效。现代医学已有研究发现，大黄素可以缓解脓毒症大鼠肺水肿的程度[4]。血栓弹力图仪(thromboelastography，TEG)能够监测凝血动态的全过程，通过测定血栓形成速度、强度和溶解过程能够真实而全面地反映凝血功能状态。已有文献报道TEG可监测脓毒症患者凝血功能变化，识别高凝与低凝状态[5]。本研究旨在运用TEG评价大黄素对脓毒症大鼠凝血功能紊乱的治疗作用。

1 材料与方法

1.1实验动物收集90只2月龄SD大鼠[购于南昌大学医学院实验动物部，合格证书：SYXK(赣2010-0002)]，体重(196.0±10.8) g。所有大鼠适应性饲养3 d，饲养环境温度19～23 ℃，空气湿度为50%～60%，动物自由饮水饮食。

1.2仪器与试剂血栓弹力图仪(西芬斯，购于北京乐普医疗科技有限责任公司)及配套试剂(包括高岭土试剂瓶、纤维蛋白原试剂瓶、0.2 mol/L氯化钙和普通杯等)；全自动凝血分析仪(RAC-500)购自雷杜医疗设备有限公司；大黄素(购于南昌乐悠生物有限公司，A606281-0025)溶液配置：准确称取1 g NaOH，用蒸馏水定容至100 mL，配制成1%NaOH溶液，准确称取大黄素100 mg溶于20 mL 1%NaOH溶液中配制成5 mg/mL 浓度溶液。10%水合氯醛(中国人民解放军第一七五医院生产)。

1.3盲肠结扎模型采用鼠类盲肠结扎穿孔法(cecalligation and puncture，CLP)建立脓毒症动物模型[6-7]。术前均禁食不禁水12 h，盲肠结扎组及大黄素组大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，常规腹部碘伏消毒、备皮和铺无菌纱布洞巾，沿剑突下腹部腹中线切开腹壁皮肤约1 cm。用无菌镊探查到盲肠后，用手术缝合线结距离回盲部1/2 处结扎大部分盲肠，20 G 无菌针头分别于被结扎盲肠头尾端穿孔，然后挤压盲肠，使其内容物沿穿孔部位挤出0.3 mL。将盲肠和挤出内容物一起送回腹腔，逐层缝合腹壁切口。

1.4实验分组大鼠适应性饲养3 d后，将90只大鼠按随机数字表法分为假手术组、盲肠结扎组和大黄素组。每组随机选取10只用于生存分析。假手术组无菌状态下开腹寻找到盲肠后再将其还纳腹腔，然后逐层关腹。假手术组术后灌胃等量等渗盐水[10 mL/(kg·d)]，2次/d，按术后6、12、24 h 随机处死大鼠并取血标本；盲肠结扎组术后灌胃等量等渗盐水，2次/d，按术后6、12、24 h 随机处死大鼠并取血标本；大黄素组在盲肠结扎术后灌喂大黄素[50 mg/(kg·d)]，2次/d，按术后6、12、24 h 随机处死大鼠并取血标本。

1.5常规凝血项目检测静脉采血2 mL，置于含有1/10体积的0.109 mol/L枸橼酸抗凝液的试管中，以3 000 r/min转速离心10 min，离心半径13.5 cm。收集上层血浆，采用全自动凝血分析仪检测PT和APTT。

1.6 血栓弹力图检测

1.6.1普通杯检测按说明书进行检测。测试完毕后记录R值、K值、α角、MA和CI参数。其中R为凝血反应时间，反映参加凝血启动过程的凝血因子的综合作用；K为从R时终点到描记幅度达到20 mm所需的时间，反映血块形成速率，其中以纤维蛋白原功能为主；α角为血凝块形成点到描记图最大曲线弧度作切线与水平的夹角；MA为血凝块最大振幅，主要反映血小板功能；CI为综合凝血指数，直接反映整个凝血的高凝或低凝状态。

1.6.2功能性纤维蛋白原检测在软件界面的测试类型中选择“CFF”；在血栓弹力图仪的通道上装载一套样品杯，取500 mL枸橼酸化全血注入纤维蛋白原试剂瓶中，颠倒试剂瓶5次使之充分混匀，静置4 min激活血液。余操作同普通杯检测。测试完毕后记录R值、MA值以及FLEV值。R时间是凝血蛋白反应时间，表明外源性凝血通路的各血因子的活性及使用抗凝剂效果。MA值即最大振幅，直接反应纤维蛋白网的交联强度，代表纤维蛋白原在凝血过程中的贡献。FLEV值为纤维蛋白原活性功能，由最大振幅MA值通过公式计算，反映血液中纤维蛋白原的含量。

2 结 果

2.1生存率分析术后48 h，假手术组大鼠无死亡，生存率为100%；盲肠结扎组大鼠存活2只，生存率为20%; 大黄素组大鼠存活4只，生存率为40%。大黄素组大鼠48 h生存率高于盲肠结扎组(P<0.05) 。见图1。

2.2各组常规凝血项目比较与假手术组相比，盲肠结扎组的APTT均在CLP术后6 h明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)；在术后6 h大黄素组较盲肠结扎组明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，盲肠结扎组和大黄素组大鼠的PT均在术后6 h显著延长，随后开始回缩，24 h缩短出现低峰(P<0.05)；但盲肠结扎组与大黄素组间无统计学意义(P>0.05)。见表1，图2。

图1 各组小鼠术后48 h生存率比较

表1术后不同时间各组大鼠APTT、PT的比较[M(Q1～Q3),n=5]

组别APTT(s)PT(s)假手术组 6 h16.7(16.2～17.2)10.6(10.0～11.2) 12 h15.8(14.6～18.4)10.2(9.8～11.0) 24 h15.2(14.6～17.2)11.0(10.2～11.2)盲肠结扎组 6 h34.6(22.7～34.9)∗24.7(15.3～31.6)∗ 12 h20.8(18.0～23.2)21.8(21.3～25.9)∗ 24 h20.4(16.5～21.3)18.6(17.9～19.0)∗大黄素组 6 h15.3(14.9～24.5)#25.5(22.7～26.1)∗ 12 h19.4(16.3～23.4)18.7(18.6～24.2)∗ 24 h16.8(16.4～18.9)16.4(15.4～17.4)∗与假手术组比较,∗P<0.05;与盲肠结扎组比较,#P<0.05

2.3各组TEG普通杯测试参数假手术组中，R值、K值、α角、MA值以及CI值在术后12、24 h差异均无统计学意义(P>0.05)。盲肠结扎组中，R值各时间点差异无统计学意义(P>0.05)；K值在术后12 h明显降低，而后逐渐回升，差异无统计学意义(P>0.05)；α角、MA值以及CI值均在术后12 h开始显著升高，于24 h到达顶点(P<0.05)。大黄素组中，R值、K值各时间点差异均无统计学意义(P>0.05)；α角、MA值以及CI值在均术后12 h开始显著升高，于24 h到达顶点(P<0.05)。与假手术组比较，盲肠结扎组的R值、K值在术后各时间点差异均无统计学意义(P>0.05)；α角仅在术后12 h显著升高(P<0.05)，MA值、CI值仅在术后6 h显著降低(P<0.05)。与假手术组比较，大黄素组的R值、K值、α角及CI值在术后各时间点差异均无统计学意义(P>0.05)；MA值仅在术后6 h显著降低(P<0.05)。与盲肠结扎组比较，大黄素组的R值、K值、α角、MA值以及CI值差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2，图3。

表2术后不同时间各组大鼠TEG普通杯参数比较(n=5)

组别R(min)K(min)α角(°)MA(mm)CI假手术组 6 h1.6±0.60.9(0.8～1.0)76.9(76.3～82.0)74.6±5.85.8(5.2～6.9) 12 h1.7±0.50.9(0.8～1.1)75.9(76.0～81.4)74.2±5.75.6(5.0～6.6) 24 h1.6±0.51.0(0.9～1.0)76.2(72.3～81.0)75.9±3.55.4(5.5～6.0)盲肠结扎组 6 h1.4±0.51.7(1.0～2.8)67.2(58.6～76.9)∗△62.8±9.4∗2.9(2.1～5.5)∗ 12 h1.3±0.31.2(1.0～1.5)△73.4(69.9～77.3)72.1±8.05.7(4.2～6.7) 24 h1.7±0.20.9(0.8～1.1)77.7(74.5～80.3)△82.0±5.5△6.5(6.0～7.5)△大黄素组 6 h1.6±0.30.9(0.8～2.0)77.4(64.6～80.9)66.5±10.2∗4.7(2.2～6.2) 12 h1.6±0.51.2(0.8～1.3)80.1(69.3～82.3)75.6±8.6△▲6.5(4.2～7.2) 24 h1.6±0.20.9(0.8～1.0)80.0(75.2～81.0)81.5±5.5△▲7.0(6.3～7.3)△与假手术组比较,∗P<0.05;与盲肠结扎组比较, #P<0.05;与同组6h比较,△P<0.05;与同组12h比较,▲P<0.05

a：部分凝血活酶时间(APTT)；b：凝血酶原时间(PT)；与假手术组比较，*P<0.05；与盲肠结扎组比较，#P<0.05图2 术后不同时间各组大鼠APTT、PT的比较

a：凝血反应时间(R)；b：血块最大强度(MA)；c：血块形成速率(K)；d：血块形成动力学(Angle)：e：凝血综合指数(CI)；与假手术组比较，*P<0.05；与盲肠结扎组比较， #P<0.05；与同组6 h比较，△P<0.05；与同组12 h比较，▲P<0.05图3 术后不同时间各组大鼠TEG(普通杯)参数比较

2.4各组TEG功能性蛋白原测试参数比较假手术组中，R值、α角、FLEV值及MA值在各时间点差异均无统计学意义(P>0.05)。盲肠结扎组中，R值各时间点差异无统计学意义；在术后12 hα角开始表现出增大趋势(P<0.05)，24 h出现下降(P>0.05)。在术后12 h，MA值与FLEV值均开始表现出升高趋势，并于24 h显著增高(P<0.05)。大黄素组中，R值各时间差异无统计学意义；在术后12 hα角开始表现出增大趋势(P<0.05)，24 h出现下降(P>0.05)。术后12 h MA值与FLEV值均开始表现出升高趋势，并在在24 h显著升高(P<0.05)。与假手术组比较，盲肠结扎组的R值与α角在术后6、12、24 h差异无统计学意义(P>0.05)；在术后6h，盲肠结扎组的MA值与FLEV值均显著降低，术后12 h差异无统计学意义(P>0.05)，均在24 h显著升高(P<0.05)。与假手术组比较，大黄素组的R值、α角在术后6、12、24 h差异均无统计学意义(P>0.05)。术后6 h大黄素组的MA值与FLEV值均显著降低(P<0.05)，术后12 h差异无统计学意义(P>0.05)，均在24 h显著升高(P<0.05)。与盲肠结扎组比较，大黄素组的R值在术后6、12、24 h差异均无统计学意义(P>0.05)；α角在术后6 h差异无统计学意义(P>0.05)，在12、24 h时显著升高；FLEV值及MA值在术后6和12 h差异无统计学意义，在术后24 h，α角、FLEV值及MA值均显著升高(P<0.05)。见表3，图4。

表3术后不同时间各组大鼠TEG纤维蛋白原杯参数比较(n=5)

组别R(min)α角(°)MA(mm)FLEV假手术组 6 h1.2±0.174.1(70.4～80.0)27.0±4.1493.1±74.1 12 h1.2±0.176.9(75.3～82.0)25.4±3.9476.8±100.9 24 h1.1±0.177.9(74.6～81.0)27.5±4.2476.5±99.8盲肠结扎组 6 h1.1±0.169.5(67.3～70.4)18.2±1.3∗331.4±24.0∗ 12 h1.1±0.373.3(73.1～75.7)△25.6±3.7△466.4±67.3△ 24 h1.2±0.070.8(69.2～78.4)28.2±4.0△515.3±73.7△大黄素组 6 h1.2±0.161.9(57.1～74.4)16.1±4.5∗343.4±60.4∗ 12 h1.1±0.177.0(74.0～78.5)#△25.2±3.9△455.9±71.7△ 24 h1.2±0.179.3(75.0～80.0)#△▲35.2±4.8∗#△▲642.3±87.3∗#△▲与假手术组比较,∗P<0.05;与盲肠结扎组比较, #P<0.05;与同组6h比较,△P<0.05;与同组12h比较,▲P<0.05

a:凝血反应时间(R);b:纤维蛋白原血块最大强度(MA);c:纤维蛋白原功能(FLEV);d:血块形成动力学(Angle)与假手术组比较，*P<0.05；与盲肠结扎组比较， #P<0.05；与同组6 h比较，△P<0.05；与同组12 h比较，▲P<0.05图4 术后不同时间各组大鼠TEG(功能性纤维蛋白原杯)参数比较

3 讨 论

脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍。该病具有较高的发病率和病死率，严重威胁人类健康[8]。近年来随着研究的不断深入,中医药治疗脓毒症成为研究的热点。中医药常通过多靶点、多途径、多机制发挥作用，对于综合调控复杂疾病更具优势与特色。因此，探讨中药对脓毒症的治疗作用具有重要意义。已有文献报道大黄素能降低血清TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平，抑制核转录因子κB(NF-κB)活性，促进炎症细胞的凋亡，从而起到抗炎的作用[9-11]。但大黄素对凝血功能的作用尚鲜有报道。

本研究结果显示,脓毒症大鼠血小板及纤维蛋白原功能先减弱而后增强的变化，大黄素能增强脓毒症大鼠内源性凝血因子活性，改善纤维蛋白原功能，降低48 h病死率。

APTT是内源性凝血系统的综合检验指标，PT反映的是外源性凝血途径的状况，R反映凝血因子活性。本实验研究结果显示,术后6h盲肠结扎组与大黄素组的APTT、PT均较假手术组明显延长，这提示早期脓毒症大鼠凝血因子活性减弱；同时大黄素组的APTT较盲肠结扎组明显缩短，但PT无明显差异；并且TEG普通杯检测以及功能性纤维蛋白原检测的结果均显示术后各组R值均无显著差异，其中功能性纤维蛋白原检测中R值反映的是外源性凝血因子活性，这说明大黄素能增强脓毒症大鼠的内源性凝血因子活性，同时提示TEG普通杯测试可能对大鼠凝血因子活性变化不敏感。血栓弹力图普通杯结果显示术后6 h，盲肠结扎组的MA较假手术组显著降低，而后呈上升趋势，这提示脓毒症大鼠早期血小板功能减弱，而后出现增强的趋势。但大黄素组的MA与盲肠结扎组无显著差异，因此本研究未能证明大黄素对脓毒症大鼠MA值有影响。

功能性纤维蛋白原的检测原理是通过组织因子激活外源性凝血通路，并使用血小板抑制剂抑制GPIIb/IIIa受体阻止血小板聚集。因此,检测的血块强度仅包含纤维蛋白原的作用。功能性纤维蛋白原检测结果显示术后6 h,盲肠结扎组与大黄素的FLEV及MA值均较假手术组明显降低，这提示脓毒症大鼠早期纤维蛋白原功能减弱。盲肠结扎组与大黄素组的α角、FLEV值及MA值在术后12 h均呈现上升的趋势，24 h显著升高。这说明随着脓毒症的发展，大鼠纤维蛋白原功能增强。并且24 h与盲肠结扎组比较，大黄素组的FLEV值及MA值有显著差异，故本研究证明大黄素能增强脓毒症大鼠纤维蛋白原功能。

脓毒症发生时，促凝物质如组织因子上调，而抗凝物质如抗凝血酶、血栓调节蛋白、组织因子途径抑制物和蛋白C下调，以及纤维蛋白溶解机制受损等，并以促凝物质上调导致高凝状态最为重要[12-14]；同时炎症介质作用于毛细血管内皮，使血管内皮生理性抗凝血物质减少或功能下降，血管内血细胞促凝血机制加强，纤溶系统受损，加剧了凝血过程[15]。纤维蛋白原即是凝血因子I，是一种由肝脏合成的可溶性Ⅱ类急性相糖基化蛋白，由αA、βB和γ链相互连接。血浆含量2.0～4.0 g/L，生物学半衰期96～144 h，存在于吸附血浆中，可被凝血酶和因子ⅩⅢa作用后转变为纤维蛋白[16]。在脓毒症高凝状态下，FIB作为凝血因子Ⅰ参与凝血过程，其活性增强。其次随脓毒症病情发展，血浆中纤溶酶原激活物抑制剂-1水平不断升高，纤溶活性受到抑制，导致血液凝固性增加，大量纤维蛋白不能被及时降解，从而增加血浆纤维蛋白原[17]。与此同时，高水平的FIB水平又促进与血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa结合，介导血小板聚集反应，导致血液黏度增大，损伤血管内皮，进一步促进凝血的过程[18]。因此随脓毒症发展，大鼠纤维蛋白原功能呈增强趋势，体现为FLEV值逐渐升高，这或许能成为评估脓毒症严重程度的指标，可作为进一步研究的方向。

综上所述，盲肠结扎模型中，脓毒症大鼠的整体凝血状态表现为低凝倾向。具体机制为凝血因子功能减弱，血小板功能先增强后减弱，纤维蛋白原功能先减弱后增强。大黄素能够改善脓毒症大鼠内源性凝血因子活性和纤维蛋白原功能，降低脓毒症大鼠48 h病死率。