不同粒径的石墨烯量子点在PC12细胞中的成像效应及细胞毒性

邓邦莲，陈雪峰，孟 蕾，易子安，秦 文，刘 龑，宋 爽，彭 超，巨妍静

随着纳米技术的高速发展，越来越多的纳米材料应用于生物成像和生物载药等生命科学领域。碳量子点(carbon dots，CDs)是一种新型的荧光纳米材料，以碳原子为基本结构单元，根据化学结构的不同分为球状结构的碳纳米点(carbon nanodots，CNDs)，具有单层或多层片状结构的石墨烯量子点(graphene quantum dots，GQDs)，或聚集颗粒状的聚合物点(polymer dots，PDs)[1]。其中，GQDs不仅具备了CNDs的优点，如：发光性能好、水溶性佳、毒性低、生物相容性优异，同时兼具了石墨烯材料的特性，如高比表面积、表面官能团丰富等[2, 3]。由于GQDs独特的性能，现已被广泛应用于生物成像、传感、生物载药等多个技术领域[4-6]。

目前研究主要集中于新的合成方法以提高GQDs的产率、表面修饰与改性、肿瘤细胞成像等方面，对于其在神经示踪及生物毒性的研究较少。GQDs对神经细胞的成像效果如何，目前研究尚浅。本研究拟通过构造GQDs与PC12细胞共培养的模型，探究不同粒径的GQDs在PC12细胞中的细胞成像效应及细胞毒性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 主要材料：15 nm与50 nm GQDs由南京先丰纳米材料科技有限公司提供。PC12细胞系购自中国科学院上海细胞库。主要试剂：澳洲胎牛血清(FBS)、DMEM培养液、PBS缓冲液(Gibco，美国)； 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(Sigma-Aldrich，美国)；CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒(Dojindo，日本)；多聚甲醛 (广州塞拉芬生物科技有限公司)

1.2 主要仪器 二氧化碳培养箱、生物安全柜(ESCO，新加坡)；医用冷藏冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)；超低温冰箱(KALTIS，美国)；超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；三用恒温水箱(金坛市杰瑞尔电器有限公司)；微量加样器(1-1000 μL)(eppendorf，德国)；M5多功能酶标仪(MDS，美国)；马尔文动态光散射仪(Malvern Instruments，英国)；激光共聚焦显微镜(Olympus，日本)。

1.3 实验方法

1.3.1 GQDs的表征 采用动态光散射法(DLS)对GQDs的水合粒径和zeta电位进行测定，测定条件为25 ℃，散射角173°，折射率1.33，激光波长633 nm。

1.3.2 PC12细胞的传代与培养 实验前进行超净台、实验器材消毒和实验试剂预热等准备工作。配置含10% FBS、1%双抗的完全培养液用于培养细胞，将其置于37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养。定期观察细胞的生长状态及培养液的颜色，光镜下健康的PC12细胞贴在培养平底，呈长梭形，培养液清亮无杂质。平均2 d进行细胞换液，当细胞生长面积占培养瓶面积80%左右时，进行细胞传代。将旧培养液弃掉，加入预热的PBS缓冲液润洗细胞1～2次，弃掉PBS缓冲液后，加入0.25%胰蛋白酶进行细胞消化5 min，直至显微镜下观察细胞变圆将要分离，加入完全培养液终止消化。使用移液器将培养瓶底的细胞吹打脱落，吹打均匀后，将细胞悬液置于15 ml离心管中，1000 r/min，离心5 min，弃上清，向离心管中加入完全培养液，重悬细胞。根据实验所需，将细胞按照1∶3或1∶4稀释至新的培养瓶中，置于37 ℃ 、5% CO2恒温细胞培养箱中继续培养。

1.3.3 不同粒径GQDs对PC12细胞系的增殖-毒性检测 (1)实验分组：空白对照组，不含细胞和实验材料的培养液；阴性对照组，含有细胞和培养液，不含实验材料；实验组，含有细胞、培养液和不同浓度的GQDs悬浮液，设置8个剂量浓度，分别是20、40、80、120、160、200、250、500 μg/ml。2个时间点：24 h、48 h。每组设置6个复孔。(2)CCK-8法测定细胞毒性步骤:收集处于对数生长期的PC12细胞，制成细胞悬液，将按照5×103每孔的密度加入96孔培养板中，每孔100 μl，将96孔培养板置于37 ℃二氧化碳培养箱恒温培养24 h。观察细胞贴壁及生长情况，弃去96孔板中原培养液，按照实验设计加入不同浓度含GQDs的细胞培养液，将96孔板放入培养箱中孵育24、48 h。在各检测时间点移除 96 孔板内的原有培养液，每孔加入预先配置的CCK-8检测液100 μl，继续培养30 ～60 min，在多功能酶标仪OD 450 nm处测量各孔的吸光度值。计算细胞相对存活率，计算公式如下：细胞相对存活率(Survive rate)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As为实验孔OD值，Ac为对照孔OD值，Ab为空白孔OD值。

1.3.4 不同粒径GQDs对PC12细胞系的荧光成像检测 收集处于对数生长期的PC12细胞，制成细胞悬液，将按照5×104每孔的密度加入共聚焦皿中，每孔2 ml，将共聚焦皿置于37 ℃二氧化碳培养箱恒温培养24 h。观察细胞贴壁及生长情况，弃去皿中原培养液，加入含250 μg/ml GQDs的细胞培养液，将共聚焦皿放入培养箱中孵育1 h。弃去共聚焦皿内原有培养液，PBS润洗2～3次。加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS润洗3次，共聚焦显微镜下观察荧光成像效果。

2 结 果

2.1 不同粒径GQDs的水合粒径和zeta电位检测 原始粒径15 nm的GQDs在去离子水中的水合粒径为(100.2±13.7)nm，zeta电位为+13.6 mV；原始粒径50 nm的GQDs在去离子水中的水合粒径为(187.6±17.5)nm，zeta电位为+11.4 mV；原始粒径15 nm的GQDs在去离子水中的水合粒径小于50 nm的，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 不同粒径GQDs对PC12细胞的增殖-毒性检测 CCK-8检测结果表明，在24 h时间点，15 nm的GQDs对PC12细胞基本无毒性作用，各浓度干预后，细胞活力均保持在80%以上，而500 μg/ml的50 nm GQDs明显降低了PC12细胞活力(P<0.05)。当干预时间达48 h时，浓度小于200 μg/ml的GQDS对PC12细胞活力基本无影响，随着GQDs作用浓度的增高，500 μg/ml的15 nmGQDs使细胞活力降至80%以下。50 nm的GQDS对PC12细胞表现出更明显的细胞毒性，浓度高于250 μg/ml后，细胞活力明显下降(图1)。

图1 不同粒径的石墨烯量子点对PC12细胞活力的影响

2.3 不同粒径GQDs对PC12细胞的荧光成像效应 两种粒径的GQDs都能被PC12细胞摄取，但是PC12细胞对15 nm的GQDs摄取得更多，80%以上的细胞都被成功显影，表现出明亮的荧光(图2)。

图2 不同粒径的石墨烯量子点对PC12细胞的成像效应(×100)

3 讨 论

材料的理化性质是影响其与细胞相互作用的关键因素。GQDs的表征结果表明，GQDs带正电荷，且15 nm粒径的GQDs表面电荷大于50 nm粒径的GQDs。由于本研究采用GQDs混悬液的方式与PC12细胞相互作用，故GQDs在水溶液中的粒径分布十分重要，50 nm的GQDs的水合粒径明显大于15 nm的GQDs的水合粒径。本研究结果表明，GQDs在溶液中有一定程度的聚合，聚合作用会影响材料与细胞的相互作用[7]，因此，处理细胞前应对材料进行分散，降低聚合作用对实验结果的影响。

随着GQDs在生命医学领域的应用日益广泛，同时人们开始担心其对机体的毒害作用。虽然目前大部分研究认为，GQDs对机体的毒性作用较低，但仍有部分学者对此持有否定的观点。Markovic等[8]报道，GQDs能诱导人神经胶质瘤U251细胞产生活性氧ROS，引起氧化应激反应，而且进一步导致细胞自噬反应及凋亡的发生。另一项研究指出，GQDs的长期暴露能导致秀丽隐杆线虫运动频率的下降、头部和咽部的异常动作，反映了GQDs对多巴胺和谷氨酸神经元的慢性毒性[9]。CCK-8检测结果反应，15 nm的GQDs对PC12细胞无明显毒性，50 nm的GQDs的细胞毒性也较低，然而随着干预浓度的增加和干预时间的延长，仍然展现出一定的毒害作用。本研究的结果与文献[10, 11]报道的结果一致，GQDs的毒性较低，是一种生物安全性较好的纳米材料，未来需要更完善的体内与体外研究来进一步确定GQDs的生物安全性。

GQDs由于其优秀的发光性能，良好的生物相容性，被应用于生物成像方面。激光共聚焦显微镜结果表明，15 nm和50 nm的GQDs都能被PC12细胞摄取，且发出明亮的荧光，成功显影PC12细胞，但是15 nm的GQDs表现出更优秀的细胞成像效应。Eda等[12]研究发现，GQDs的光学性能是尺寸依赖性的，粒径越小的GQDs光致发光强度越高。此外，GQDs的细胞成像效应也与细胞对其的摄取率相关。研究发现，细胞对纳米颗粒的摄取与其粒径、形状、比表面积、表面电荷和表面修饰等因素相关[13，14]。尺寸越小的纳米颗粒更容易被细胞摄取[15]。此外，纳米颗粒的表面电荷是影响细胞对其摄取的另一个重要因素[16]，研究发现，由于细胞膜表面带有负电荷，相比起阴性电位的纳米颗粒，阳性电位的纳米颗粒更容易被吸附到细胞表面，甚至进入细胞内[17]。15 nm的GQDs表面带的正电荷比50 nm的电荷高，因此更容易被细胞摄取。本实验的结果表明，PC12细胞对GQDs的摄取是呈尺寸依赖性的，尺寸小的GQDs生物毒性低，更容易被细胞摄取，细胞成像效应更好，更适合用于神经系统生物成像。

综上，本实验探究了不同粒径的GQDs在PC12细胞中的毒性与荧光成像效应，结果证实，小粒径的GQDs对PC12细胞的细胞毒性更低，更容易被细胞摄取，细胞成像效果更好。GQDs是一种合适的神经示踪材料，其在神经系统的应用与毒理研究需更进一步的探究。