灵芝菌丝体银杏叶发酵乳饮料的研制

冉景盛，王慧超，陈今朝，冉明才，陈 春

（1.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100；2.重庆市彭水第一中学校，重庆 409600）

0 引言

灵芝（Ganoderma lucidum） 含有多糖、核苷和三萜化合物等物质，灵芝多糖主要的生物活性成分具有调节免疫力、抗肿瘤和延缓衰老等功能[1-2]。但灵芝人工栽培周期长、劳动强度大、品质不稳定[3]。液体发酵法制备灵芝菌丝体不仅周期短、成本低，而且多糖、三萜等物质含量更高。银杏（Ginkgo）叶含黄酮类化合物、萜内酯类化合物，具有抗氧化、降血糖和调血脂等作用，可以治疗血栓、改善心脑血管循环功能。以灵芝、银杏叶和还原牛乳制备营养丰富、口味新颖的保健饮料，为促进灵芝、银杏叶深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

灵芝菌种：灵芝子实体于2016年8月采自重庆市石柱县大风堡，并在生物技术实验室分离保藏；银杏叶：2017年9月2日采自长江师范学院校园；发酵菌剂为保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌（1∶1），生物技术实验室保藏；脱脂乳粉，购于涪陵区马鞍超市。

TYS-100型高速多功能粉碎机，浙江省永康市红太阳机电有限公司产品；TGC-16C型台式离心机，上海精密科学仪器有限公司产品；JY96-IIN型超声波细胞破碎仪，宁波生物科技有限公司产品；GYB40-OS型高压均质机，上海东华高压均质机厂产品；ZSD-1090型生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司产品。

1.2 工艺流程

①灵芝菌丝体→离心→烘干→粉碎→超声波提取→过滤→多糖提取液；

②脱脂乳粉→复原→加蔗糖→加稳定剂；

③银杏叶→清洗→烘干→粉碎→超声波提取→过滤→黄酮提取液；

①+②+③→调配→均质→灭菌→冷却→接种→发酵→后熟→感官鉴定→成品。

1.3 试验方法

1.3.1 灵芝菌丝体制备

将灵芝斜面菌种0.5 cm2种块接入液体培养基100 mL于250 mL三角瓶，在28℃，转速120 r/min条件下培养120 h。将发酵液过滤、洗涤菌丝球，于105℃条件下烘干，备用。

1.3.2 pH值对灵芝多糖产量的影响

将 pH 值为 3.4，3.8，4.2，4.6，5.0，5.4，5.8，6.2，6.6，7.0培养液分别置于250 mL锥形瓶中，接种10.0%发酵菌剂；于28℃条件下培养120 h，测定菌丝体生物量、多糖产量。

1.3.3 菌丝体多糖提取液的制备

将发酵液用150目滤网过滤，用蒸馏水洗涤菌丝体3次，于80℃条件下真空干燥至恒质量；按料液比为1∶15（W/V），称菌丝体干粉，加蒸馏水置圆底烧瓶中；于60℃条件下超声提取2次，每次25 min；过滤，合并滤液，得多糖提取液，备用。

1.3.4 银杏叶黄酮提取液的制备

将新摘银杏叶分选、清洗，于105℃条件下烘干至恒质量，粉碎过60目筛；按料液比为1∶6（W/V），称取银杏叶粉于250 mL锥形瓶中，加95%乙醇；超声波提取时间分别为30，20，10 min；过滤，合并滤液，减压蒸馏得黄酮提取液，备用。

1.3.5 发酵菌剂制备

将保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌（1∶1） 接种于无菌还原乳中，于42℃恒温条件下培养2 d，于4℃冰箱中保存备用。

1.3.6 乳饮料发酵培养基制备

将多糖提取液、黄酮提取液、牛乳和蔗糖混匀，水浴预热，在65℃，20 MPa条件下均质15 min。

1.3.7 灭菌

将均质液于80℃水浴加热15 min，冷却至40～42℃。

1.3.8 接种发酵

将均质液分装于瓶中，接入4.0%的发酵菌剂，于42℃恒温条件下培养4 h。

1.3.9 不同因素添加量对饮料品质的影响

（1）多糖提取液添加量对饮料品质的影响。将黄酮提取液4.0%，蔗糖10.0%，β-环状糊精和还原乳0.080%混匀，分别加入2.0%，4.0%，6.0%，8.0%的多糖提取液，接入4.0%的发酵菌剂，于42℃恒温条件下培养4 h。根据饮料的颜色、乳清析出、组织状态、气味和口味进行评分，确定多糖提取液的适宜添加量。

（2）黄酮提取液添加量对饮料品质的影响。将多糖提取液4.0%，蔗糖10%，β-环状糊精和还原乳0.080%混匀，分别加入3.0%，4.0%，5.0%，6.0%的黄酮提取液，按上述方法接种、培养，评定饮料质量，确定黄酮提取液的添加量。

（3）蔗糖添加量对饮料品质的影响。将多糖提取液4.0%，黄酮提取液4%，β-环状糊精和还原乳0.080%混匀，分别加入6.0%，8.0%，10.0%，12.0%的蔗糖，按上述方法接种、培养，评定饮料的品质，确定蔗糖的添加量。

（4）还原乳添加量对饮料品质的影响。将多糖提取液4.0%，黄酮提取液4.0%，蔗糖10.0%和β-环状糊精0.080%混匀，分别加入10.0%，12.0%，14.0%，16.0%的还原乳，按上述方法接种、培养，评定饮料的品质，确定还原乳的添加量。

1.3.10 最适配方的确定

选取多糖提取液添加量、黄酮提取液添加量、蔗糖添加量和发酵菌剂接种量4个因素，设计L9（34）正交试验。根据感官品质评价标准评分，确定最适配方。

L9（34）正交试验因子与水平设计见表1。

表1 L（934）正交试验因子与水平设计/%

1.3.11 冷藏后熟、鉴定

将发酵乳饮料迅速降温至10℃以下，于4℃冰箱冷藏后熟24 h，测定合格为成品。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 感官评价标准

用感官评价法评价饮料的品质。根据饮料的颜色、乳清析出、组织状态、气味和口味综合评分，10人评分，总分为100分。

饮料感官评价标准见表2。

1.4.2 理化指标

灵芝多糖：采用苯酚-硫酸法测定；黄酮：采用紫外分光光度法测定；蛋白质：按GB/T 5009.5—2003测定；脂肪酸、含乳固形物和酸度：均按GB/T4 789.2003测定。

表2 饮料感官评价标准

1.4.3 微生物指标

致病菌：按GB/T 4789.4检测；大肠菌群：按GB/T 4789.3检测。

2 结果与分析

2.1 pH值对菌丝体干质量、多糖产量的影响

当培养液的pH值为5.4时，菌丝体生物量最大，为2.401 7 g/100mL；pH值为5.4时，多糖产量为0.235 2 g/100 mL。因此，适宜pH值为5.4。

pH值对菌丝体生长、多糖产量的影响见图1。

图1 pH值对菌丝体生长、多糖产量的影响

2.2 单因子试验结果

2.2.1 多糖提取液添加量对饮料品质的影响

添加4.0%多糖提取液时，乳饮料感官品质较好。多糖提取液添加量对饮料品质的影响见表3。

2.2.2 黄酮提取液添加量对饮料品质的影响

添加3.0%黄酮提取液时，饮料的感官品质较好。黄酮提取液添加量对饮料品质的影响见表4。

2.2.3 蔗糖添加量对饮料品质的影响

添加10.0%的蔗糖时，饮料的感官品质较适宜。蔗糖添加量对饮料品质的影响见表5。

2.2.4 接种量对饮料品质的影响

表3 多糖提取液添加量对饮料品质的影响

表4 黄酮提取液添加量对饮料品质的影响

表5 蔗糖添加量对饮料品质的影响

接种量为2.0%对饮料的感官品质较适宜。

发酵菌剂接种量对饮料品质的影响见表6。

表6 发酵菌剂接种量对饮料品质的影响

2.3 正交试验结果

各因子影响顺序为 RB＞RC＞RD＞RA，即黄酮提取液添加量＞蔗糖添加量＞发酵菌剂接种量＞多糖提取液添加量。最佳发酵工艺配方为A2B1C2D3，即多糖提取液添加量4.0%，黄酮提取液添加量3.5%，蔗糖添加量10.0%，发酵菌剂接种量3.0%。

L9（34）正交试验结果分析见表7。

2.4 产品品质标准

表7 L9（34）正交试验结果分析

感官指标：乳白色，颜色纯正，有光泽；无乳清析出；质地均匀、稳定；灵芝、银杏叶香味较淡，香味协调；口感清爽，酸甜适。

理化指标：灵芝多糖含量≥0.15%，黄酮含量≥0.002 0%；蛋白质含量≥3.6%，脂肪含量≥0.20%，含乳固形物含量≥8.0%，总酸度80～90°T。

微生物指标：乳酸菌数≥1×108个/mL，细菌总数≤100个/mL，大肠菌群数≤6个/100 mL，致病菌不得检出。

3 结论

灵芝菌丝体银杏叶发酵乳饮料的最佳发酵工艺配方为灵芝菌丝体多糖提取液添加量4.0%，银杏叶黄酮提取液添加量3.5%，蔗糖添加量10.0%，还原乳添加量12.0%，β-环状糊精0.080%，发酵菌剂接种量4.0%，于42℃恒温条件下培养4 h；此时乳饮料为乳白色，组织状态、质地均匀，无乳清析出；具有清爽的银杏叶和灵芝香味，营养丰富、酸甜适宜、风味独特。