涠洲牛Y-SNPs和Y-STRs遗传多样性及父系起源研究

李秀良，李芳玉，曹艳红，吴柱月，党瑞华，李绍波，陈 宏，雷初朝*

(1.广西壮族自治区畜牧研究所，广西南宁 530001；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100)

中国黄牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛，起源上包括普通牛和瘤牛两个牛种，二者的共同祖先是原牛[1]。作为世界牛品种资源宝库的重要组成部分，我国地方黄牛品种具有丰富的遗传多样性。1986年，邱怀[2]在《中国牛品种志》将中国黄牛整理分类后分成了28个地方黄牛品种，同时按照地理分布区域的不同，把中国黄牛分为北方黄牛、中原黄牛和南方黄牛3大类。涠洲牛的中心产区在广西北海市的涠洲和斜阳两岛，其中涠洲岛的牛群约占总数的96%，斜阳岛占4%，在北海市及合浦县等地区也有少量分布。涠洲牛经过产区风土驯化，具有体型饱满、耐热和耐粗饲、适应性强、繁殖率高、屠宰率高等优点。随着涠洲岛旅游开发力度加大，为了符合市场经济发展的需要，涠洲牛作为役用逐渐减少，更多的作为肉用[3]。

Y染色体由雄性特异区(MSY)和拟常染色体区(PAR)两部分组成，其中MSY区在减数分裂时不与X染色体发生重组[4]，具有父系遗传特性，且Y染色体的单倍型完整，具有较低的突变率，不易受重组和回复突变等因素影响，是探明父系遗传多样性、起源和驯化历史等研究的理想工具[5]。根据以往的一些研究发现，家牛具有Y1、Y2和Y3三种单倍型组，其中Y1和Y2单倍型组代表普通牛起源，而Y3单倍型组为瘤牛起源[6,7]。利用位于Y染色体MSY区的单核苷酸多态性标记(Y-SNPs)可以确定家牛的Y染色体单倍型组[6]，利用微卫星标记(Y-STRs)，可以更精确地反映3种单倍型组内丰富的Y染色体单倍型[8,9]，将这两种标记结合起来使用可以更完整地反映Y染色体单倍型结构。

Zhang等[10]利用5个Y-SNPs(ZFY-9、ZFY-10、DDX3Y-7、DDX3Y-1和UTY-19)标记对4个中国地方牛品种共96个雄性个体进行了遗传多样性分析，结果发现这5个Y-SNPs标记能够将普通牛和瘤牛区分开来。Cai等[11]对25个中国地方黄牛品种共423头个体的2个Y-STRs(UMN2404和UMN0103)标记进行基因分型和多态性分析，发现这两个位点具有明显的多态性，可以区分普通牛和瘤牛血统。迄今为止，尚未见到有关涠洲牛分子水平上的Y染色体遗传多样性及父系起源的报道。因此，本研究利用2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)及2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)对28头涠洲牛公牛进行多态性检测，通过分析涠洲牛Y染色体的单倍型组成，来探明该群体的遗传多样性、群体遗传结构及父系起源。

1 材料与方法

1.1 采样及基因组DNA提取

在广西壮族自治区涠洲岛保种场采集涠洲牛28头公牛的耳组织，低温保存带回实验室，采用常规酚-氯仿法提取基因组DNA，稀释浓度至10～20 ng/μL，保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

参照Gotherstrom等[12]和Ginja等[8]报道的2个家牛Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)以及Edwards等(2011)的研究中的Y-STRs标记(INRA189和BM861)合成四对引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μLPCR体系：2×PrimeSTAR Max Premix (上海宝生物公司)12.5 μL，上、下游引物 (10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超纯水10.5 μL。PCR反应程序：98℃变性10 s，Ta℃(见表1)退火15 s，72℃延伸10 s，35个循环，后冷却至4℃保存。PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶(含GoldView核酸染料)电泳后，凝胶成像系统拍照检测。

1.3 PCR产物测序、分型及数据统计分析

将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序和分型，利用DNASTAR 7.1(DNASTAR, Madison, WI, USA)软件对Y-SNPs测序结果进行统计，利用GeneMarker V1.91软件对Y-STRs分型结果进行查看和校正。利用Y-SNPs的2个标记先确定家牛的单倍型组，继而结合Y-STRs的2个标记的分型结果，二者共同确定出每头黄牛的Y染色体单倍型(Y-SNP-INRA189-BM861)。最后使用Arlequin 3.0软件计算群体单倍型多样度(H±SD)。

2 结果与分析

通过对28头涠洲牛公牛的2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)的测序分析，并参考Gotherstrom等[12]和Ginja等[8]对家牛Y染色体单倍型组的判定标准，结果表明：这两个Y-SNPs标记在28头涠洲牛中均具有多态性，其中UTY-19标记发现一个C>A 核苷酸颠换，在ZFY-10标记发现1个C>T核苷酸转换和1个GT插入/缺失，表明28头涠洲牛只包含Y3一种单倍型组。对2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)进行多态性分析，结果显示：INRA189有两种等位基因，大小分别为88 bp和90 bp，而BM861只有一个156 bp的等位基因。结合Y-SNPs和Y-STRs标记确定涠洲牛的单倍型为Y3-88-156和Y3-90-156(表2)，频率分别为89.29%(25/28)和10.71%(3/28)，表明涠洲牛只有1个瘤牛父系起源。涠洲牛群体的单倍型多样度为0.1984±0.0924，表明父系遗传多样性很低。

表1 家牛2个Y-SNPs位点及2个Y-STRs位点的名称、位置、退火温度与引物序列

表2 涠洲牛Y染色体单倍型与单倍型频率

3 讨论

Y染色体分子遗传多样性是研究动物父系起源和群体遗传多样性的重要工具。近年来，Y-SNPs标记和 Y-STRs标记被广泛应用于动物Y染色体遗传多样性研究[6-9]，将这两种标记结合起来使用可以更精确地反映Y染色体单倍型结构。近几年来，国内外越来越多的研究已经将二者结合起来分析黄牛群体的Y染色体遗传多样性和父系起源[8]。涠洲牛是广西自治区优良的地方品种，目前为止，关于涠洲牛的分子水平上的遗传多样性、群体遗传结构和父系起源的研究未见报道。

中国黄牛主要存在普通牛Y2和瘤牛Y3两种父系起源，普通牛在中国北方地区占优势，瘤牛主要分布在南方地区，中原地区为二者交汇处[6]。本研究结果表明涠洲牛只有一个Y3单倍型组，说明涠洲牛只有1个瘤牛父系起源，涠洲牛分布在南方地区，与常振华等[6]研究结论相符合。夏小婷等[13]对32头关岭牛的Y-SNPs(USP9Y基因)和2个STRs标记(INRA189和BM861)进行遗传性分析，发现关岭牛以瘤牛Y3父系起源为主，还具有普通牛Y2父系起源。侯佳雯等[14]利用2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)和2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)对35头皖南公牛进行遗传多样性分析，结果发现皖南牛具有Y1、Y2和Y3 3种单倍型组，以瘤牛Y3父系起源为主，其中Y1单倍型组可能是由外来牛品种的雄性基因渗入所致[7]。李芳玉等[15]利用2个Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)和2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)，发现49头大别山牛全部为Y3-88-156单倍型，表明该品种只有Y3瘤牛父系起源，其遗传多样性很低，表明其瘤牛种质特性单一、稳定。关岭牛、皖南牛、大别山牛与涠洲牛都为南方黄牛，其中涠洲牛只有Y3单倍型组而不具有Y1和Y2单倍型组，说明涠洲牛和大别山牛一样，只有一个瘤牛父系来源，血统单一，没有受普通牛Y2的影响，也不存在外来牛品种的雄性基因渗入现象，其遗传资源保存较好。

单倍型多样度是衡量一个群体变异程度的重要指标。目前在分子水平上尚未见到有关涠洲牛单倍型多样度的报道，本研究中28头涠洲牛的Y染色体单倍型多样度为0.1984±0.0924，低于我国16个黄牛品种的Y染色体单倍型多样度的平均值[7]。说明涠洲牛的父系遗传多样性较低。涠洲牛是役肉兼用型黄牛地方品种，涠洲岛和斜阳岛与内陆有大海相隔，长期以来，涠洲牛都是本品种自然交配进行纯种繁殖。公牛的选育多采用选优去劣的方法，大部分公牛被阉割，只留少数做种用，可能是导致本品种的遗传多样性较低的原因。这也说明涠洲牛品种的遗传基础稳定，品种较纯。近年来，涠洲牛群体数量有逐年下降的趋势，该品种处于濒危维持状态[3]，因此，应当加大涠洲牛保种开发力度，建立健全涠洲牛保种体系，使得这一优良的种质资源得以保护和开发利用。