秦川牛CDH11基因外显子多态性分析

程嘉慧，李卓妮，邬明丽，高源，樊英智，李世鹏，赖振雨，雷初朝，党瑞华

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

CDH11基因编码E-钙黏蛋白，属于钙粘蛋白超家族，对个体发育起着重要的作用：E-钙黏蛋白是哺乳动物发育过程中第一个表达的钙黏蛋白，可促进小鼠8细胞胚胎时期的细胞黏合过程，调控钙黏蛋白的种类与数量，可以决定胚胎细胞的黏着，影响细胞分化和器官的形成[1]。

牛的CDH11基因位于18号染色体上，含有11个外显子。研究者们发现CDH11基因与成骨功能紧密相关，在MC3T3-E1细胞培养1周后CDH11表达增加伴ALP活性上调，提示在成骨分化期两者具有协同性表达机制[1]，这种具有特异性的钙粘蛋白在成骨细胞系中的表达及其在分化过程中的上调作用，表明该基因在骨的发育和维持中起特定功能[2]。同时，表达的蛋白可通过“同嗜”效应介导骨的形成并维持微环境中不同种骨细胞的相互通讯和对话。

Alimperti.S等人研究发现CDH11基因表达的钙粘蛋白-11是MSC分化成平滑肌细胞所必需的蛋白，说明基于钙粘蛋白-11的粘附连接在MSC分化为SMC的过程中以及在含有SMC的组织的收缩功能中起到至关重要的作用，提示CDH11基因表达产物对诱导干细胞分化具有潜在的意义[3]。陈子坚等人研究发现CDH11基因促进膀胱癌细胞迁移和侵袭，与膀胱癌分级、分期、复发、进展等指标呈正相关，提示CDH11也许可以作为预测膀胱癌的生物标记物[4]。Craciun.F等人的研究表明，CDH11是CKD特征性肾纤维化的新型尿生物标志物[5]。Assefnia.S等人发现CDH11基因与发育中的上皮细胞间充质转化，恶性肿瘤的扩散和癌症干细胞相关，也是类风湿性关节炎(RA)中的具有快速检测潜力的治疗靶标[6]。Li.Y研究表明钙粘蛋白-11作为细胞-细胞粘附分子优先在基底样乳腺癌细胞中表达，并通过促进小GTP酶Rac活性促进乳腺癌细胞迁移[7]。这些研究表明CDH11基因表达的钙黏蛋白-11在癌症细胞迁徙转移过程中起到重要作用，并且是许多癌症和风湿性关节炎的生物标志物，在人类医学上具有重要研究价值。

国外肉牛群体中基于大群体GWAS分析鉴定结果表明[8]，CDH11基因可能是影响肉牛体尺性状的重要基因。结合CDH11基因对胚胎时期的成骨细胞系的发育、促进胚胎细胞紧密黏合等生物学过程起到重要的作用，提示该基因可能参与牛早期胚胎发育的调节过程，对牛的成骨过程和器官形成产生重要的作用，从而影响牛的断乳期体重、饲喂效率以及死胎率。

目前国内对CDH11基因的研究主要集中在小鼠的神经疾病分析以及成骨作用和关节炎病理分析上，对秦川牛CDH11基因外显子多态性的研究还未见报道，因此本研究将初步鉴定CDH11基因在秦川牛群体中的遗传变异，并分析其基因频率、基因型频率，检测研究的位点是否符合哈代-温伯格平衡，研究其遗传多态性水平，为今后针对秦川牛开发出适用于中国肉牛选育的分子标记提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验中所使用的牛血液样本取自247头秦川牛。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 使用北京艾德莱生物科技有限公司全血/组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取秦川牛个体的血样DNA。

1.2.2 引物设计和PCR扩增 使用Primer 5.0设计引物，共设计出2对引物，基因的序列信息来自NCBI(GeneBank登录号：NC_007316.6)，引物信息见表1。

表1 牛CDH11基因引物序列

引物合成完成后，以秦川牛的混合DNA池(由50个不同DNA的样本各1 μL混合成一个DNA池)作为模板进行PCR扩增。PCR扩增总体积共12.5 μL：其中包括12 μL体系和0.5 μL的混合DNA池模板。体系组成为：6.25 μL 2×Taq Master Mix(2×PCR缓冲液，3 mmol/L MgCl2，1UTaq DNA 聚合酶和400μmol/L dNTP 混合物)，4.75 μLddH2O，上下游引物各0.5 μL。PCR扩增程序为：预变性95℃ 5 min；95℃变性30 s；退火55℃30 s；再于72℃延伸30 s，共进行32个循环，最后72℃延伸10 min，于4℃保存。PCR完成后对扩增产物进行电泳，使用1%PAGE电泳进行检测。PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.3 PCR-RFLP分析 根据NCBI上的序列信息，发现了位于第二个外显子上的第32935629位基因的SNP突变。采用PCR-RFLP分析对247个秦川牛样品进行分型。使用Xcm-1为限制性内切酶，酶切体系为：PCR扩增产物5 μL，1 μL buffer缓冲液，1.5 U(5 000 U/mL)限制性内切酶，4μL ddH2O。置于37℃酶切3 h，酶切产物使用1%PAGE电泳检测，检测结果使用凝胶成像系统进行观察并统计分型结果。

1.2.4 数据分析 利用Excel等软件分析遗传多态性指标，对于分型的统计结果分别计算出基因型频率和基因型频率。利用SHEsis在线软件检测群体是否符合哈代-温伯格平衡，使用MSRcall在线数据分析(www.msrcall.com/)进行SNP突变位点的遗传多态性分析。

2 结果与分析

在秦川牛的CDH11基因外显子2(g.32935629 C>T)上鉴定了1个SNP,对此SNP位点的多态性进行了分析。图1显示了该SNP位点的变异情况及其酶切分型多态性结果，基因测序结果显示该SNP突变位点是C>T型的突变。

此SNP位点适合选用限制性内切酶Xcm-1进行酶切分型，酶切位点的分型结果统计见表2。结果表明：该SNP突变位点存在3种基因型(WW，WD，DD)。

统计各个位点的基因型，计算基因型频率和基因频率，并利用SHEsis在线软件检测群体是否符合哈代-温伯格平衡，结果如表3所示。统计结果发现，此SNP突变位点上的W等位基因是优势等位基因，在三种基因型中，野生型WW所占比重较大，WD次之，DD基因型个体最少，在247头秦川牛中仅发现1例。纯合子突变(DD)的基因型频率很低，仅为0.004；而杂合子(WD)的基因型频率较高，为0.117。χ2检验显示，所检测的秦川牛此位点处于哈代-温伯格平衡状态(P> 0.05)。

利用MSRcall在线数据分析(www.msrcall.com/)进行该位点的遗传多态性分析，得到的结果如表4所示。PIC多态信息含量结果显示，所检测的秦川牛在该位点的遗传多态性呈低度多态(PIC<0.25)。

表2 牛CDH11基因PCR-RFLP多态性

表3 牛CDH11基因型和等位基因频率，以及基因多态性位点的哈代-温伯格平衡检测

表4 牛CDH11基因遗传多态性分析

图1 CDH11基因外显子2(g.32935629 C>T)处SNP检测和扩增产物Xcm-1 PCR-RFLP电泳分析

3 讨论

CDH11基因表达的E-钙黏蛋白由N端的胞外结构域，以及高度保守的C端胞质结构域组成。目前，已有超过100种钙黏蛋白分子在脊椎动物和非脊椎动物中被发现。钙黏蛋白家族各个组分之间的比例对动物个体的生长发育起到重要的调节作用，提示CDH11基因可能与肉牛体尺发育有关。许多研究也发现由CDH11基因所表达的钙黏蛋白-11在膀胱癌、乳腺癌等癌症细胞的迁徙转移过程中发挥重要作用，可以作为许多癌症和风湿性关节炎等疾病诊疗过程中的生物标记物，说明CDH11在机体中发挥着多种功能。

本研究对247头秦川牛基因组中CDH11基因外显子2(g.32935629 C>T)上的SNP突变进行多态性分析，利用Xcm-1限制性核酸内切酶对该位点进行多态分型，采用1%PAGE电泳检测酶切分型结果。我们发现该位点共有3种基因型，其中未突变个体占绝大多数，杂合突变基因型WD的频率为0.117，而纯合突变DD的基因型频率为0.004，纯合突变基因型数量极少。进行哈代-温伯格平衡检测，发现检测群体处于哈代-温伯格平衡状态(P > 0.05)。进行遗传多态性分析，发现多态信息含量(PIC)该指标为0.111，说明秦川牛CDH11基因外显子2(g.32935629 C>T)该位点的SNP突变为低度多态(PIC<0.25)。

肉牛业是畜牧业的重要组成部分，但目前我国大量繁育的地方肉牛品种普遍存在着体格小，生长速度缓慢，屠宰率和净肉率较为低下等缺点，难以满足现代肉牛业的发展和人民生活的需求，因此开发有效的生长发育分子标记具有重要意义。国外肉牛群体中GWAS分析提示CDH11可能和肉牛生长发育有密切关系，因此在国内优秀肉牛品种中调查该基因多态具有重要意义，本研究结果表明在我国秦川牛品种中，CDH11基因外显子2(g.32935629 C>T)上存在多态，该突变呈现低度多态，且纯合突变率极低。本研究结果可以为下一步开发研究针对秦川牛品种的遗传分子标记提供基础数据和实验思路。