广西水牛唾液和血清生殖激素在发情周期的变化规律及相关性分析

2018-09-21贾银海莫志辉潘能庆徐文文蒋世强杨秀荣蒋和生

中国牛业科学 2018年4期

贾银海, 莫志辉，潘能庆，徐文文，蒋世强，邓辉，杨秀荣*，蒋和生*

(1.广西大学动物科技学院，广西南宁，530001；2. 广西巴弗罗牧业投资有限公司，广西南宁，530003.)

水牛是我国的主要畜种之一，全国水牛的分布又以广西居首。水牛属于单胎动物，但因其适应性强，肉和奶具有较高的经济价值而受到普遍关注[1]。与其他牛科动物相比繁殖率相对较低，其表现在发情外部症状和发情规律不明显[2]。影响水牛繁育的因素很多包括营养、管理、气候环境、年份或季节和疾病等[3]。应用现代辅助生殖技术也不能有效的提高水牛的妊娠率[4]，因此，掌握有效的水牛发情鉴定及最佳配种时间的确定在水牛生产中具有非常重要的意义。目前国内外主要是通过测定水牛血液[5]、尿液[6]、粪便[7]等中的激素水平来对水牛的发情进行鉴定。但血液样本的采集难度较大，若操作不当会给水牛造成生理上的伤害和各种应激反应。祝晓丽等[8]对广西沼泽型水牛发情淡季的生殖激素的变化规律进行了研究，发现水牛血样中E2和P4呈波动性变化，且存在显著性相关。谢炳坤等[5]对广西黄牛和水牛发情周期血清生殖激素变化规律进行了研究，发现与自然发情的水牛相比，水牛同期发情处理可能会显著性的影响发情期的FSH的分泌水平。与血液采集相比，唾液的采集操作简便、无侵入性且不易对水牛造成伤害。唾液中的钙、无机磷、镁、钠、钾、氯在发情阶段比其他阶段显著增高，而且氯的水平与血液中的P4的水平呈显著性负相关[9]。唾液中发情期雌激素水平和E2/P4的比率与其它阶段相比显著升高[10]，这是国外首次报道水牛唾液激素水平。因此，通过采集唾液代替血液测定水牛的生殖激素，对水牛的繁育工作具有极大的现实意义。目前国内鉴定水牛发情方面的研究大多采用血液样品进行研究，采用唾液对水牛的发情规律进行研究国内还未见报道。本研究主要是应用ELISA试剂盒检测发情水牛外周血清和唾液中的雌二醇(E2)和孕酮(P4)的变化规律，分析血液和唾液中两种激素在整个发情周期中的动态变化规律及激素间的相关性。旨在通过本实验的研究确定一种更加准确、操作简单的发情判定方法，为今后研究水牛的发情排卵规律及指导生产提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

试验水牛8头，来自广西南宁市某水牛场，所有牛只为经产牛，年龄48岁之间，健康，膘情中等，无生殖系统疾病，饲养方式相同。

1.2 发情观察

认真观察和记录水牛的食欲变化、表现、性情以及产奶量等的变化情况，推算母水牛的发情周期，采用直肠检查法触摸卵巢，检查母水牛的子宫角的对称情况、大小、形状，反应以及卵巢上卵泡的发育情况，采用直肠检查法+ B超检查法，监测水牛卵巢上的卵泡发育情况来判断是否发情。

1.3 样品收集

1.3.1 血液样本采集及处理对观察到的发情母水牛进行采血，每天采血1次，连续采集21 d。采血时间为早上饲喂前6：307：00，颈静脉采血35 mL，4 000 r/min 离心10 min，将分离的血清分装至于密封管中，做好标记保存于-80℃备用。

1.3.2 唾液样本采集及处理采用咀嚼式或巴斯特吸管抽吸法进行收集，将采集的唾液移至离心管，12 000 r/min 离心10 min，取上清液至Eppendorf管中，编号并保存于-80℃超低温冰箱中待检测。

1.4 激素测定

采用ELISA试剂盒，对采集的血液和唾液的样品进行激素测定，按照试剂盒说明书进行操作。将处理好的唾液及血清样本从-80℃超低温冰箱中取出，放置4℃冰箱中使其溶解，用 ELISA检测试剂盒检测样本中的 P4和E2 含量。

1.5 数据统计分析

唾液及血清中P4和E2 的浓度值，差异显著性检验及相关性分析均采用SAS统计软件分析。

2 结果与分析

2.1 水牛正常发情周期唾液和血液中孕酮及雌二醇水平的变化

2.1.1 母水牛唾液和血清中P4在整个发情周期期间的水平变化

图1 自然发情水牛血液和唾液P4激素变化规律

从图1可以看出，水牛唾液和血液中P4激素水平变化情况，从发情前期，母水牛血清中P4的浓度一般在9.910.8 ng/mL之间,在13天血清中P4浓度达到12.84 ng/mL以上，随后快速下降。从唾液P4浓度变化可以看出，在发情前期，唾液中P4 浓度一直维持在6.57.1 ng/mL，在911 d 唾液中孕酮浓度显著升高，第13天达到11.09 ng/mL以上，随后快速下降。唾液P4浓度的变化趋势和血清P4 浓度的变化趋势基本相同，有较高的相关性。

2.1.2 母水牛唾液和血清中E2在整个发情周期期间的水平变化从图2可以看出，水牛唾液和血液中E2激素水平变化情况，从发情前期，母水牛血清中E2的浓度在46 d，出现第一个峰值228.292 pg/mL,之后增长速度逐渐放慢，在第1 517天血清中E2 浓度达到244.698 pg/mL以上，达到第二个峰值。唾液中E2 浓度在发情前期第35天出现一个峰值178.528 pg/mL，在1 417 d 唾液中E2浓度显著升高，出现第二个峰值达到120.57 pg/mL以上。唾液 E2浓度的变化趋势和血清E2浓度的变化趋势基本相同,相关性较好。

2.1.3 母水牛唾液中E2和P4在整个发情周期期间的水平变化从图3可以看出，母水牛唾液中E2浓度在排卵后第1 517天以及排卵前35天出现峰值，P4浓度在排卵后第1天开始升高，第13天时达到峰值，并在排卵前3天下降到基础水平。这与图1和图2母水牛血清样品中E2和P4的变化趋势基本一致。

2.2 母水牛血液和唾液中E2和P4激素之间相关性分析

母水牛唾液和血清标本的P4浓度相关性显著(R=0.4080;P<0.05), 母水牛唾液和血清标本的E2浓度相关性显著(R=0.5113;P<0.05)母水牛唾液E2和P4浓度相关性非常显著(R=0.7754;P<0.01).

图2 自然发情水牛血液和唾液E2激素变化规律

图3 自然发情水牛唾液E2和P4激素变化规律

3 讨论

通常性激素均采用血清或尿液等样品进行测定，而血清中性激素的测定值为血液循环过程中总浓度，不能反应有生物活性的游离激素的水平。由于水牛在整个发情周期中性激素的水平呈周期性的变化，水牛属于全年发情动物，且发情症状不明显，因此，在生产中较难准确判定母水牛的发情排卵时间，要获得较为详细的资料，必须多次采集样品。若全部采用血浆标本测定激素水平，用血量大且需多次采集给牛只造成的应激影响很大。若用尿液测定，要保证收集全天收集是比较困难的，且采集单次尿液又受饮水量、代谢率及运动等诸多因素的影响[6]。由于唾液中不含性激素结合球蛋白(SHBG),血浆中的类固醇激素以超过滤的方式迅速向唾液中转运，故唾液中的性激素浓度可反映血浆中相应的游离激素水平[11]。且取材方便，对母水牛无损伤，无应激影响。类固醇激素的性质稳定，体外代谢率低[1],对测定的结果无明显的影响。因此，唾液性激素的测定是研究母水牛发情周期激素变化规律的有效途径。近年来，随着科研人员对唾液与血液指标检测的相关性研究日渐深入。从本实验结果可以看出，唾液中测得的E2和P4浓度变化与血清中E2和P4 变化基本保持一致,这与[10-12]的报道结果一致。且唾液P4浓度在母水牛发情期间从6.741 ng/mL 逐渐升高，到第13 天含量达到11.095 ng/mL，与血液 P4 含量变化具有较高的相关性，在 0.05 水平上显著相关，相关系数平均达到 0.4080。唾液E2浓度在母水牛发情期间从第5天出现一个峰值178.53 pg/mL，到第16天含量179.10 pg/mL出现第二个峰值，与血液 E2含量变化具有较高的相关性，在 0.05 水平上显著相关，相关系数平均达到0.5113，且唾液中E2和P4浓度在0.01水平上显著相关，相关系数平均达到0.7754。本实验结果说明，母水牛发情期间的唾液P4和E2 与血清P4和E2 具有较好的相关性，有望将唾液代替血液对母水牛的激素变化进行测定，以此对母水牛进行发情鉴定并判断最佳配种时间。但本实验仍然存在许多不足，与真正应用于生产实践的要求仍存较大差距。其次，本试验以广西区内水牛作为研究对象，无法证实用唾液E2和P4测定代替血清E2和P4测定在其他地域不同水牛品种间的应用是否具有可行性。再次，母水牛的年龄、体重、身体状况等的不同都会影响到唾液 P4 与血液 P4 的相关性。综上所述，将唾液检测运用到母水牛发情鉴定及最佳配种时间的确定，仍存在较多不确定因素，需进一步探究。