延边牛Y染色体遗传多样性与父系起源研究

史红侠，姚一博，夏小婷，吕 忠，党瑞华，蓝贤勇，陈 宏，雷初朝,*

(1. 渭南市动物卫生监督所，陕西 渭南，714000；2. 西北农林科技大学动物科技系统，陕西 杨凌，712100；3. 国家肉牛牦牛产业技术体系延边综合试验站，吉林 延边 133000)

哺乳动物Y染色体的绝大部分区域为非重组区，也称雄性特异区(MSY区)，其突变率低，不容易受到重组和回复突变的影响，并且遵循父系遗传，是研究动物遗传多样性、父系起源和驯化历史的理想工具。国内外学者基于Y染色体单核苷酸多态性 (Y-SNPs) 和微卫星 (Y-STRs) 分子标记，对家牛 (包括普通牛和瘤牛) 进行了较为系统的父系遗传研究，结果表明家牛包含普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3单倍型组。利用Y-SNPs标记可区分家牛的3种单倍型组，利用Y-STRs标记可精细区分各单倍型组内的不同单倍型[1]。

延边牛是我国五大地方良种黄牛之一。吉林省延边朝鲜族自治州是延边牛的主要产区，主要分布于图们江流域和海兰江流域的延吉市、龙井市、图们市和珲春市等地。延边牛是延边各族人民精心选育的品种，早在清道光年间(1821-1850)，中国人民和朝鲜人民就有往来，随着朝鲜移民迁入，将朝鲜牛输入我国东北地区，经与本地黄牛杂交、改良培育出适合延边地区自然条件的延边牛。延边牛耐寒、耐粗饲、抗病能力强，具有遗传性能稳定、役用性能强、肉质风味独特等优点，是培育我国专门化肉牛品种的良好资源，有很高的经济价值和开发潜质，市场开发前景广阔[2]。

目前，国内研究者对中国黄牛群体遗传多样性、种群遗传结构及起源的研究主要集中在mtDNA和Y染色体分子标记方面[3-11]。王朝锋等[3]通过对延边牛mtDNA D-loop序列进行分析，发现延边牛为普通牛母系起源。然而，关于延边牛的父系遗传多样性及遗传背景的研究报道相对较少[9]。因此，本研究利用Y染色体经典特异性分子标记Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)对32头延边牛的遗传多样性进行检测，通过分析单倍型组成和单倍型多样度来探究延边牛的群体结构和父系起源，为开展该品种的分子育种和资源保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集与基因组DNA提取

从吉林省延边州延边牛国家遗传资源保种场采集32头延边牛公牛耳组织于-80℃保存备用。采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

1.2.1 UTY19和ZFY10基因的合成、PCR扩增 参照已发表的家牛Y染色体UTY19、ZFY10标记引物信息[8]合成2对Y-SNPs引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为12.5 μL：上、下游引物各0.25 μL (10 pmol·L-1)，2×Taq MasterMix 6.25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 5.25 μL。扩增条件为：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，36个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。将合格PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.2 荧光微卫星引物的合成与PCR扩增 参照Edwards等[1]报道的分型方法合成2对荧光Y-STRs引物(INRA189和BM861)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为12.5 μL，其中上、下游引物各0.25 μL (10 pmol·L-1)，2×Taq MasterMix 6.25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 5.25 μL。扩增条件为：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，Ta℃退火30 s，72℃延伸30 s，36个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。采用2.0%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司分型。

1.3 数据统计

通过2个Y-SNPs标记的判定结果(表1)和2个Y-STRs标记的分型结果[1]，确定每头黄牛的Y染色体单倍型(Y-SNP-INRA189-BM861)。用ARLEQUIN V3.11软件计算单倍型频率和单倍型多样度(H±SD)。

2 结果与分析

2.1 延边牛Y-SNPs多态性

对延边牛UTY19和ZFY10基因的PCR产物进行测序，发现2个标记在32头延边牛中均具有多态性：在UTY19标记上发现1个C>A颠换，在ZFY10标记上发现一个GT插入/缺失位点(表1)。参照Li等[10]对家牛Y染色体单倍型组的判定标准，32头延边牛中仅有1头属于Y1单倍型组，其余31头均属于Y2单倍型组，Y1和Y2单倍型组个体所占频率依次为0.031和0.969，表明所有的延边牛均属于普通牛起源。

2.2 延边牛Y-STRs多态性

延边牛2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)的检测结果表明，在INRA189座位中共检测到3个等位基因，大小分别为98 bp、102 bp和104 bp，所占个体数为1、30、1，其中98 bp对应Y1单倍型组，102 bp和104 bp对应Y2单倍型组。而在延边牛的BM861座位中未发现多态性，仅检测到158 bp一种等位基因。

表1 延边牛Y染色体单倍型组的判定标准

2.3 延边牛Y染色体单倍型频率和单倍型多样度

根据Edwards等[1]报道的Y-SNPs标记与Y-STRs标记结合的单倍型分型方法，对32头延边牛的单倍型进行分析(Y-SNP-INRA189-BM861)，共确定3种单倍型，其中1头为Y1单倍型(Y1-98-158)，30头为Y2单倍型(Y2-102-158)，剩下的1头为Y2单倍型(Y2-104-158)。3种Y染色体单倍型频率分别为0.031，0.938和0.031。延边牛Y染色体单倍型多样度为0.1230±0.0777。

3 讨论

动物Y染色体分子遗传标记是目前研究父系起源的重要工具。大量的研究表明[1, 5-8, 10, 11]，家牛共有3种Y染色体单倍型组，分别是普通牛Y1和Y2单倍型组，瘤牛Y3单倍型组。Edwards等[1]利用Y-SNPs和Y-STRs分子标记分析了欧洲和亚洲共138个牛品种，结果表明Y1单倍型组主要分布在欧亚大陆北部，Y2单倍型组主要分布在中东和欧洲南部地区，Y3单倍型组则主要集中在东南亚地区。中国是世界上黄牛品种资源最丰富的国家之一，目前我国有53个地方黄牛品种[2]。按地理分布区域的不同，中国黄牛可以分为北方黄牛、中原黄牛和南方黄牛三大类。关于中国黄牛的起源、进化和遗传多样性，国内学者在Y染色体分子遗传多态性[5- 11]及线粒体DNA多态性[3-4, 6]等方面做了大量研究，结果均支持我国黄牛为多元起源的观点，普通牛主要影响北方黄牛，瘤牛主要影响南方黄牛，而中原地区的黄牛同时受到普通牛和瘤牛的影响。

常振华等[11]和Li等[10]先后对16个中国地方黄牛品种的Y染色体遗传多样性、群体遗传结构和起源进行分析，结果均表明北方黄牛以Y2单倍型组为主，南方黄牛以Y3单倍型组为主，中原黄牛包含普通牛Y2和瘤牛Y3单倍型组，同时还发现少量黄牛品种(哈萨克牛、秦川牛、吉安牛)中含有少量的Y1单倍型组。Cai等[9]分析了25个中国地方黄牛品种的2个Y-STRs标记(UMN2404和UMN0103)多态性，发现延边牛与安西牛、西藏牛、蒙古牛同属普通牛父系起源。本研究采用2个Y-SNPs标记(UTY19和ZFY10)和2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)结合的单倍型分型方法[1]，确定延边牛有3种Y染色体单倍型(Y1-98-158、Y2-102-158和Y2-104-158)，其中Y2-102-158单倍型占主导地位(93.8%)，说明延边牛是以Y2单倍型组为主的普通牛父系起源。按照地理分布延边牛属于北方黄牛，本研究结果与Cai等[9]、Li等[10]和常振华等[11]的研究结果一致。中国黄牛中少量Y1单倍型组的检测可能与国外引进牛品种的基因渗入有关[10]。

单倍型多样度通常被用来衡量一个群体的变异程度，单倍型多样度越高的群体遗传多样性越高，遗传资源越丰富。在本研究中，32头延边牛的单倍型多样度为0.1230±0.0777。而Edwards等[1]报道的138个国外牛品种的单倍型多样度平均值为0.422±0.3，Li等[11]分析的中国16个黄牛品种的单倍型多样度平均值为0.6831±0.0134，均大于本研究中32头延边牛的单倍型多样度，表明延边牛Y染色体单倍型多样度和分子遗传多样性较低。这可能是由于延边牛群体所处的地理位置偏北方，缺乏与其他牛群体的基因交流，父系起源单一，导致该群体较低的单倍型多样度。同时也说明延边牛品种内纯度高，品种资源遗传稳定。