虎眼万年青愈伤组织培养的研究

赵栢翎 张玮 夏辰旭 关凤涛 杨国会

【摘 要】以虎眼万年青子鳞茎为外植体，以MS培养基为基本培养基，附加6-BA及NAA，对其愈伤组织的生长情况进行研究。试验结果表明：适于愈伤组织诱导的培养基为MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，适宜的继代培养基为：MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，形成的愈伤组织质地疏松，颜色浅黄而透明，形成易分散的颗粒。在25℃，130r/min，600Lx 12h的循环光照下在MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L 的液体优化培养基中培养，18天后，筛选获得最佳虎眼万年青的悬浮细胞系。

【关键词】虎眼万年青;愈伤组织;悬浮细胞系

虎眼万年青（Ornithogalum caudatum Ait）为百合科虎眼万年青属常绿多年生草本植物的干燥全草，又名胡连万年青、海葱、葫芦兰、珍珠草、鸟乳花，属常见的观赏花卉，原产于非洲南部，我国各地广泛栽培[1]。虎眼万年青有极高的药用价值，虎眼万年青球茎中含有大量的生物碱及化学成分，已测出的化学成分有27种之多，药理学研究表明虎眼万年青中的虎眼万年青皂苷OSW -1对肺癌、乳腺癌有明显的抗癌活体，体外抗p338淋巴细胞白血病活性结果表明，0SW - 1是常见抗癌药物喜树碱、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10～100倍，而且对正常细胞没有毒性，因此，是一种极具开发潜力的中草药[2]。服用本品可以增强人体免疫功能，抑制肿瘤，预防高血压、糖尿病、动脉硬化等疾病[3]。有研究表明，虎眼万年青不仅是一种观赏花卉，而且也是一种具有开发前景的药用植物[4]。本项目主要进行虎眼万年青细胞培养研究。经查新，目前关于虎眼万年青细胞培养的研究方面的文献资料还未见报道。为此，笔者着重研究不同激素配比的培养基对虎眼万年青组织培养的研究，确定出最佳方案，为实现大规模生产化工厂化提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

虎眼万年青子鳞茎，2018年1月采自吉林农业科技学院九站校区。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒 取虎眼万年青子鳞茎，剥去表皮并用饱和洗衣粉侵泡1h，然后用自来水反复冲洗干净，移入超净工作台，用75%的酒精浸泡50s，再用0.1%HgCl2溶液处理15min，无菌水冲洗3-5次。

1.2.2 培养基 愈伤组织诱导的初代培养基共9种配比，分别记做：A1：MS+6-BA0.5mg/L+NAA1.5mg/L;A2：MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.5mg/L ; A3：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 1.5mg/L;A4：MS+6-BA0.5mg/L+NAA 2.0mg/L;A5：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 2.0mg/L ;A6：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 2.0mg/L ;A7：MS+6-BA0.5mg/L+NAA 2.5mg/L;A8：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 2.5mg/L;A9：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 2.5mg/L;诱导愈伤组织的继代培养基共4种配比，分别记做：B1：MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.5mg/L;B2：MS+6-BA0.5mg/L+NAA2.5mg/L;B3：MS+6-BA1.0mg/L+NAA2.5mg/L;B4：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L;建立细胞悬浮体系的液体培养基共3种配比，分别记做：C1：MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA1.5mg/L;C2：MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L;C3：MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA2.5mg/L。

1.2.3 接种和培养 将每个子鳞茎切成8块接种到培养基上，每个培养瓶接种2块，每个处理接种10瓶，共90瓶，形态学下端插入培养基，培养温度（25±2℃），进行暗培养。培养20d后，选择诱导率高的愈伤组织继续进行继代培养，每瓶接种2块，每个处理接种20瓶，共80瓶，培养温度（25±2℃），进行暗培养，20d接种到液体培养基上进行摇床培养，接种量为10g/130mL，温度25℃，转数130r/min，600Lux，12h循环光照，装液量130mL/250mL，培养18d，观察愈伤组织生长状况[5]。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比浓度的培养基对虎眼万年青愈伤组织诱导的影响。

在相同条件下（基本培养基相同，培养条件相同），当激素NAA为1.5 mg/L时，随着6-BA浓度梯度的增加，愈伤组织的平均诱导率逐渐增加;当激素NAA为2.0 mg/L时，随着6-BA浓度梯度的增加，愈傷组织的平均诱导率增加不是很明显，诱导率增幅较小;激素NAA为2.5 mg/L时，随着6-BA浓度梯度的增加，愈伤组织的平均诱导率出现下降趋势。试验数据采用SPSS 13.0软件进行分析，由表1-2可知，A1与A4、A5、A6、A2、A9差异不显著，A1与A7、A8差异显著，A3与A7、A8差异显著，A1与A3差异极显著，即最佳培养基为A3：MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.5mg/L ，在A3中平均诱导率达到96.67%，效果最好，为继代时形成质地疏松的愈伤组织打下基础。

2.2 不同激素配比浓度的培养基对虎眼万年青愈伤组织生长的影响 。

在相同条件下（基本培养基相同，外界培养条件相同），当激素NAA为2.5mg/L时，6-BA浓度由0.5mg/L增加至1.0mg/L，愈伤组织的平均诱直径减少了1.49mm;当激素6-BA的添加量是NAA添加量20倍时，显然抑制了愈伤组织的生长;当NAA的浓度与6-BA的浓度比为1：1时，最适合其生长。试验数据采用SPSS 13.0软件进行分析，由表2可知，B1与B4、B3极显著，B1与B2显著，B2与B4显著。可得最适合愈伤组织生长的培养基是B1 ：MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，在液体培养中有优势，增长效果明显。

在愈伤组织继代的第20天时，B1中有较大的球状颗粒，因质地松软可在液体悬浮培养中有较大的明显;B4中NAA浓度小于6-BA浓度，不适宜愈伤组织的生长而且较其他培养基相比生长缓慢，几乎不形成颗粒，颜色偏绿。

2.3 不同激素配比浓度的液体培养基对虎眼万年青愈伤组织悬浮体系形成的影响

愈伤组织在液体悬浮培养时起初生长极为缓慢，在第10天左右时，生长速度明显增加，质地疏松的愈伤组织在悬浮培养时易分散，充满整个培养基，体积逐渐变大，质地紧实的则在外围直接长出小的、形状不规则的愈伤组织，无分散现象。在液体培养的第18天时，经观察，愈伤组织在C2中的分散颗粒最多，长势最好;C3次之;而在C1中长势最差几乎无改变。因此，最适合愈伤组织的液体培养基是C2：MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L 。初步形成无菌悬浮体系，为下一步研究提供了可靠的理论依据。

3 结论与讨论

植物激素虽用量极小，但是培养基中的关键物质，而且在植物组织培养中起着重要和明显的调节作用。用于植物组织培养的激素包括生长素、赤霉素和细胞分裂素等。生长素的主要

作用在于诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生及试管苗的生根，需要注意的是在使用时要配合其他激素;细胞分裂素有促进细胞分裂和分化，延迟组织衰老，增加蛋白质合成，抑制顶端优势，促进侧芽生长并且可以改变其他激素作用的特点。

脱分化是植物组织培养环节中成败的关键，为建立无菌体系打下良好的基础，试验研究过程中还发现外植体初代培养时间不宜过长，导致愈伤组织干瘪，水分缺失，影响继代。

在愈伤组织的培养过程当中，出现污染的现象不可避免。本实验在继代培养的第3天，有培养基出现污染情况，第一种污染现象是在试验材料附近出现粘液状物体，培养基变浑浊（图3）;第二种不同污染现象是在第五天时，培养基出现颜色变化，部分呈现绿色，还有一部分为黑色块状，一直扩散到培养基最底部。经查阅文献 ，得知前者为细菌污染，主要的来源是由于接种材料和工具灭菌不彻底;后者为真菌污染，主要来源于环境。

通过试验初步确定虎眼万年青形成愈伤组织初代培养最适培养基是MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，继代培养基为：MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，液体悬浮培养基为MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L 。此结论为实现虎眼万年青生产工厂化提供了一定的参考依据。

参考文献：

[1] 张瑜，赫玉芳，南敏伦，等.虎眼万年青研究进展[J].中南药

学，2010，8，（04）：293-295.

[2] 肖冲，鱼红闪.虎眼万年青皂苷的分离提取[J].大连轻工业

学院学报，2006，（02）：93-95.

[3] 丁景和.药用植物学[M].上海：上海科学技术出版社， 1985.

[4] 杨国会，缪承阳，米春江.不同碳源对虎眼万年青离体生长

的影响[J].安徽农业科学，2009，37，（34）：16767-16768.

[5] 杨国会，米春江，缪承阳.不同激素水平对虎眼万年青组织

培养的影響[J].湖北农业科学，2011，50，（01）：183-184+188.