长期口服恩替卡韦治疗的慢性乙型肝炎患者换用α干扰素治疗临床疗效随访研究

王芳芳，张国范，郭春霞，杨振浩，潘延凤，余祖江

近年来，我国急性 HBV感染明显减少，但随着感染 HBV人口的老龄化，其带来的危害仍然是严重的负担[1]。慢性乙型肝炎（CHB）治疗的目的是达到病毒清除、延缓肝脏失代偿、肝硬化和肝细胞癌的发生，进而改善患者的生活质量和延长生存时间[2]。HBV复制被认为是影响CHB疾病进展的最危险因素[3]，核苷（酸）类似物（NAs）能有效抑制 HBV DNA复制，其临床应用有效地阻断了CHB的进展[4，5]。然而，大部分口服NAs的CHB患者在停药后会出现病毒学反弹，引起疾病复发[6-8]，少数患者在停用NAs后会诱发肝衰竭[9]。α干扰素具有提高免疫反应的作用，可以增强针对HBV的特异性免疫功能，在停药后具有较持久的应答反应[10]。因此，经NAs治疗长期应答的CHB患者在换用α干扰素巩固治疗后，是否可以停止治疗，值得探索。本研究选择长期口服恩替卡韦治疗且应答良好的CHB患者换用重组人干扰素α2b治疗，观察了其疗效情况，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究属于前瞻性队列研究，选择自2006～2010年以来在我院长期口服恩替卡韦治疗而获得病毒学应答的CHB患者120例，男75例，女性45例，平均年龄46.5±12.3岁。诊断符合亚太（APASL）乙型肝炎防治指南的标准[11]，接受恩替卡韦治疗时间为7～11（8.4±2.6）年。所有病例均符合以下纳入标准：（1）年龄≥25 岁；（2）口服恩替卡韦至少7年以上；（3）血清HBeAg阳性，而血清HBV DNA 阴性。排除标准：（1）有严重心、肺、脑、骨髓等器官、系统疾病者；（2）有肾功能障碍或潜在肾脏病病史者；（3）有自身免疫性疾病史，包括甲状腺机能亢进症、糖尿病病史者；（4）合并其他病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、慢性血吸虫病、代谢性肝病和代偿期或失代偿期肝硬化患者；（5）有癫痫、抑郁和其他中枢神经系统疾病者；（6）对干扰素过敏者；（7）合并 AIDS 等其他病毒感染者。将患者随机分成两组，两组在年龄、性别、治疗时间和病情方面比较，无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。所有患者签署知情同意书，本研究获本院医学伦理委员会批准。

1.2 治疗方法 观察组继续口服恩替卡韦治疗12周，同时给予重组人干扰素α-2b（安达芬，安徽安科生物）3～6 MIU肌肉或皮下注射，1次/d，连用15 d，后改为隔日1次，至48 w。在注射α-干扰素治疗12 w时停用恩替卡韦；对照组继续口服恩替卡韦至48 w。两组停药后，均随访24 w。

1.3 临床检测 使用贝克曼公司生产的全自动生化分析仪检测血生化指标；采用ELISA法检测血清HBV标记物（Abbott试剂盒，其中血清HBsAg的检测水平为0.05 IU/ml）；采用实时荧光定量PCR法检测 HBV DNA（Rotor-Gene 6000，Corbett Research公司）。

1.4 疗效判断标准 停药24 w病毒学复发（virologicalrelapse，VR）被定义为血清HBV DNA定量检测重新大于1×104copies/ml；生化学复发（clinical relapse，CR）被定义为血清谷丙转氨酶（ALT）水平大于正常值上限2倍以上。

1.5 统计学方法 应用SPSS 18.0软件和Cochran Mantel-Haenszel检验进行统计学处理，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用x2检验，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 两组复发率比较 停药后随访24 w，观察组病毒学和临床复发率显著低于对照组（P＜0.01，表1）。

表1 两组复发率（%）比较

2.2 两组血清HBsAg和HBeAg阴转率和HBV DNA复阳率比较 在停药随访24 w时，观察组血清HBsAg和HBeAg转阴分别为11例（18.3%）和13例（21.7%），而对照组无血清HBsAg和HBeAg阴转病例（0.0%和0.0%，P＜0.05）；观察组血清 HBV DNA复阳10例（16.7%），显著低于对照组的42例（70.0%，P<0.05）。

2.3 两组血清HBsAg水平变化的比较 在治疗和随访过程中，观察组患者血清HBsAg水平均呈下降趋势，但对照组患者血清HBsAg水平均无显著变化。自治疗24 w开始，两组患者血清HBsAg水平存在显著差异（P＜0.01，表2）。

2.4 不良反应情况 观察组患者在注射干扰素期间，均出现发热、肌肉酸痛等流感样症状，发生白细胞计数下降57例，红细胞计数下降2例，血小板计数下降41例，出现甲状腺功能亢进3例。所有出现不良反应的患者均给予对症处理，全部病例均按照 试验设计要求完成治疗，无退出病例。

表2 两组血清 HBsAg 水平（IU/ml，±s）变化比较

表2 两组血清 HBsAg 水平（IU/ml，±s）变化比较

例数 治疗前 治疗24 w 48 w 停药24 w观察组 60 3097.7±289.9 1944.7±268.6 530.7±261.3 512.4±176.7对照组 60 3091.6±280.3 3080.4±255.1 3087.1±264.1 3148.5±212.3 t值 - 0.121 2.838 11.60 11.54 P值 - 0.904 0.005 0.000 0.000

3 讨论

虽然在核苷（酸）类似物出现后使CHB的治疗有了划时代的改变，但长期用药后出现了种种不尽如人意的问题，如耐药和停药后病情复发问题，其中最严重的问题是停药后诱发肝衰竭。因为，核苷（酸）类似物属于HBV DNA聚合酶的抑制剂，可以抑制HBV DNA复制，但是其并不能清除肝细胞核内HBV共价环状闭合DNA（cccDNA）和前基因组RNA（pgRNA）的合成[12，13]。HBV cccDNA 在肝细胞核内与组蛋白结合，形成一种微小染色体，充当新病毒前基因组RNA合成的模板，并确保后代病毒颗粒的形成[14，15]。因此，HBV cccDNA代表了病毒在宿主体内持续感染的存在，也是核苷（酸）类似物停药后复发和无法治愈的主要原因[16]。CHB患者病情复发与HBV cccDNA有关是可以解释的，但是核苷（酸）类似物停药后出现病毒学反弹并诱发肝衰竭可能还是与HBV RNA有关。HBV RNA是装备完整的乙型肝炎病毒外壳内含有的HBV pgRNA，在口服核苷类似物的患者由于药物阻断了病毒从pgRNA逆转录成HBV DNA，因而在此类患者的肝细胞中存在大量的HBV RNA病毒颗粒[17]。尽管我们在患者血液中检测不出HBV DNA，但是血液中存在着大量的HBV RNA病毒颗粒，HBV RNA病毒颗粒在停药后会迅速转化成HBV DNA，我们认为这是诱发病情加重的生物学原因[18，19]。

尽管口服核苷（酸）类似物不能清除肝细胞核内的HBV cccDNA和和阻断HBV RNA合成，但是它可以完全阻断HBV DNA的形成，经过长期口服核苷（酸）类似物患者体内不存在HBV DNA，从而进一步阻断了新的HBV cccDNA的形成，为α干扰素治疗提供了发挥最大药效的机会。因为有研究显示[20]，α干扰素具有抗病毒和免疫调节的双重作用，其介导的免疫应答能在病毒生命周期的多个不同环节抑制HBV复制。首先，α干扰素的抗病毒作用可以实现清除患者体内HBV RNA的作用，因为α干扰素诱导的MxA蛋白可以使得HBV RNA核衣壳破坏，从而将HBV RNA暴露于胞浆中[21]，而α干扰素诱导的 OAS/RNase抗病毒通路可以降解HBV RNA，从而最终实现患者体内 HBV RNA的清除[22]。理论上，可以防止核苷（酸）类似物停用患者出现病毒学反弹。本研究在停用恩替卡韦的患者换用α干扰素后没有出现病毒学反弹，而对照组在停用后出现了病情加重，佐证了推测的正确性。其次，α干扰素可以不破坏肝细胞，即通过APOBEC蛋白的碱基切除修复通路，直接消除肝细胞内HBV cccDNA[23]，也可以破坏病毒感染的肝细胞，即通过诱导针对病毒的特异性细胞毒性T淋巴细胞应答，从而间接消除HBV cccDNA[24]。本研究在注射α干扰素的观察组患者血清HBsAg持续下降并出现多例HBsAg阴转患者，表明α干扰素确实可以通过直接或间接消除HBV cccDNA，因为有研究显示[25]患者血清HBsAg水平与肝内HBV cccDNA水平高度相关，降低HBsAg水平意味着肝内的HBV cccDNA已经降低。另外，α干扰素还能通过表观遗传学修饰的方式沉默HBV cccDNA。HBV cccDNA是一种微小染色体，α干扰素能够使与其结合的组蛋白的去乙酰化和甲基化，使得HBV cccDNA处于高度浓缩的染色体状态而不能转录，达到抑制HBV前基因组RNA和mRNA合成和转录[26]。本研究结果也支持以上的观点，在停止治疗后随访24周时，观察组患者血清HBsAg水平依然持续下降，且病毒学复发率为11.7%，显著低于对照组的率65.0%（P＜0.05），显示经α干扰素治疗后大多数患者肝细胞HBV cccDNA可能已经被沉默而不能再产生子代病毒颗粒了。

综上所述，针对长期口服恩替卡韦等核苷（酸）类似物治疗的CHB患者，虽然血清不存在HBV DNA，但是其肝细胞中可能还存在HBV cccDNA和HBV RNA，也是造成恩替卡韦停药后病情复发和病毒学反弹的主要生物学原因，而应用α干扰素能够消除和沉默HBV cccDNA，并清除HBV RNA，因而可以达到清除病毒和预防停药后病情复发的作用。本研究结果显示，长期口服恩替卡韦治疗的CHB患者在达到完全应答后换用重组人干扰素α2b继续治疗，可以有效降低患者血清HBsAg水平，预防恩替卡韦停药后病情复发和病情加重。该方案可能是目前长期口服核苷（酸）类似物治疗的CHB患者安全停药的最有效的方法，且能让部分患者因出现血清HBsAg消失而达到临床治愈，值得临床进一步验证。