葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶siRNA对7702肝细胞增殖的影响及机制研究*

李俊峰，郑素军，刘霜，任锋，陈煜，段钟平

在糖鞘脂代谢过程中，葡萄糖化神经酰胺合成酶（glucosy lceramide synthase，GCS）是催化神经酰胺进行糖基化的关键酶[1-5]。我们之前的研究均表明鞘脂及其代谢在多种肝脏疾病的发生发展中扮演重要的角色[6-8]。最近我们发现丙型肝炎患者血浆糖化神经酰胺的变化与肝内坏死性炎症的发生风险明显相关[9]。我们推测内源性GCS可能与肝细胞的增殖和凋亡有一定的联系。本研究利用体外siRNA技术干扰GCS基因表达，观察了肝细胞的增殖和相关凋亡通路的变化，目的在于探讨GCS在肝细胞增殖过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞 人源肝细胞株7702细胞为首都医科大学附属北京佑安医院人工肝中心长期保存。RPMI 1640培养基（美国Hyclone公司），10%胎牛血清（美国Hyclone公司），细胞培养箱（美国Thermo公司）。

1.2 siRNA转染细胞 取对数生长期的7702细胞，每孔取1×105细胞，铺于24孔板。置于培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃去上清，每孔加入siRNA和Lipofectamin 2000混合液。同时将无血清无抗生素的1640培养基作为空白对照组，同时将只加转染试剂的Lipofectamin 2000作为转染试剂组。培养6 h，在荧光显微镜下观察转染效率。采用实时荧光定量PCR法检测UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶（UDP-glucose ceramide glucosyltransferase，UGCG）siRNA对靶基因GCS的干扰效果。UGCG siRNA 序列为：正向（5’→3’）CGC GAA UCC AUG ACA AUA UTT，反向 （5’→3’）AUA UUG UCA UGG AUU CGC GTT；阴性对照siRNA序列为：正向 （5’→3’）GCGACGAUCUGCCUAAGA UdTdT，反向（5’→3’）AUC UUA GGC AGA UCG UCG UCG CdTdT。人 GCS 引物序列：正向（5’→3’）TTC ATG TGT CAT TGC CTG GC，反向（5’→3’）AGC GTA ATC TGT AGC GAC CA。

1.3 UGCG siRNA对肝细胞增殖的影响 采用MTT法检测。

1.4 细胞 Bcl-2、Bax和 Caspase 3基因水平检测 采用实时荧光定量PCR法，取7702细胞1×105个/孔，铺种于24孔板，加入完全培养基1 mL，培养细胞24 h，待细胞贴壁生长后，分为转染组和UGCG siRNA干预组，培养6 h，换成无血清培养基，继续培养至24 h。然后，提取细胞RNA。采用紫外分光光度法测定总RNA浓度及纯度，在37℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min 进行反转录反应，合成cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测mRNA水平：反应体系为20μl，PCR循环参数为：步骤 1：50℃ 2 min；步骤 2：95℃ 10 min；步骤3：95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 个循环。人源 GCS、Bcl-2、Bax和Caspase 3基因引物序列为：人Bcl-2正向 （5’→3’）：GTG GCC TTC TTT GAG TTC GG，反向 （5’→3’）：GGC CGT ACA GTT CCA CAA AG；人 Bax正向（5’→3’）：ATG AAG ACA GGG GCC CTT TT，反向（5’→3’）：GCA ATC ATC CTC TGC AGC TC；人 Caspase 3正向（5’→3’）：ACT GGA CTG TGG CAT TGA GA，反向（5’→3’）：GCACAAAGCGACTGGATGAA；人GAPDH 正向（5’→3’）：CCA GAA CAT CAT CCC TGC CT，反向（5’→3’）：CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG。

1.5 肝细胞Caspase 3蛋白表达检测 采用Western blot法检测，取对数生长期7702细胞，调整细胞密度为3～3.5×105/m1，在wRNA干预组，37℃培养6 h，换成无血清培养基培养至24 h，分离蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。配制12%分离胶10 ml和5%浓缩胶5ml，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转PVDF膜，用5%脱脂奶粉按1:800比例配制兔抗人Caspase-3单克隆抗体，将膜浸于抗体中4℃摇床过夜，用5%脱脂奶粉按1:2000比例配制抗兔二抗，浸膜，室温下摇床上孵育1 h，将ECL发光试剂A与试剂B以1:1比例混合后，将PVDF膜曝光，扫描分析。应用Image J software 1.46软件分析条带灰度值。

1.6 统计分析 应用SPSS 19.0软件行数据分析，计量资料以（±s）表示，采用独立样本t检验或Mann-Whitney检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UGCG siRNA对肝细胞转染的抑制作用 将siRNA和转染试剂按照不同比例转染（两者以VsiRNA:VLipo=3:1的比例转染，siRNA终浓度为0.12 μmol/L）。将UGCG siRNA和阴性对照siRNA以VsiRNA:VLipo=3:1的比例转染7702细胞24 h后，采用PCR法检测siRNA对靶基因GCS基因水平的抑制效果，结果发现转染UGCG siRNA组相比转染试剂组，GCS基因水平有明显被抑制的现象（P<0.05），而转染阴性对照siRNA组GCS基因水平相对转染试剂组无明显变化（图1）。

2.2 各组细胞增殖率比较 与单独转染试剂Lipofec tamin 2000转染细胞比，转染UGCG siRNA后肝细胞增殖明显被抑制（P<0.05，图2）。

2.3 各组细胞肝细胞凋亡相关分子mRNA水平比较 结果发现相比转染试剂组，UGCG siRNA转染组肝细胞Bcl-2 mRNA水平显著下降（P<0.05），Bax mRNA水平显著升高（P<0.05），Caspase 3 mRNA水平同样上调（P<0.05，图3）。

图1 各组UGCG siRNA转染肝细胞后糖化神经酰胺酶mRNA水平比较 表明UGCG siRNA能够降低GCS基因水平

图2 各组细胞增殖率比较 表明UGCG siRNA能够抑制7702肝细胞增殖

图3 各组细胞肝细胞凋亡相关基因mRNA水平比较 表明UGCG siRNA能够下调Bcl-2 mRNA水平，上调Bax和Caspase 3 mRNA水平

2.4 各组细胞Caspase 3蛋白表达情况比较 结果发现与转染试剂组比，转染UGCG siRNA肝细胞Caspase 3表达量上调（图4）。

图4 各组细胞Caspase 3蛋白表达情况 表明UGCG siRNA能够上调肝细胞Caspase 3蛋白的表达

3 讨论

本研究的主要发现为首次验证了抑制GCS的基因表达可能会导致肝细胞的凋亡。本研究在设计上采用siRNA技术靶向干扰GCS的基因表达，进而在GCS表达特异性抑制的基础上，探讨GCS对肝细胞增殖的影响及其可能的信号通路。由于凋亡信号通路错综复杂，因此本文为初步研究，未能观察GCS基因表达的抑制对其他凋亡信号通路的影响。但是，基于目前的研究结果，我们推测肝细胞内源性GCS可能参与了肝细胞的生长周期。

在鞘脂代谢中，GCS是催化神经酰胺进行糖基化的关键酶，通过影响神经酰胺和糖鞘脂的代谢平衡来调控细胞的生理活性。在神经酰胺的糖基化过程中，葡萄糖连接在神经酰胺的1-羟基基团，从而产生葡萄糖神经酰胺[14,15]。GCS是UGCG基因编码的内在膜蛋白，在所有真核细胞膜上表达。在GCS表达下降或者活性减低时，神经酰胺糖基化水平下降，导致神经酰胺水平升高，升高的神经酰胺是有效诱导细胞凋亡的介质，能够触发内源性和外源性细胞凋亡。而神经酰胺激活调控细胞凋亡的主要途径主要为内质网和线粒体途径[8]，并参与到TNF α介导的凋亡通路中[16]。本研究首先验证靶向针对GCS基因的UGCG siRNA序列的干扰效果，发现该UGCG siRNA序列能够抑制GCS基因的表达，继而在此前提下，进一步观察利用siRNA技术特异性抑制GCS的基因表达对肝细胞增殖的影响。结果发现肝细胞的增殖受到明显抑制，转染UGCG siRNA的肝细胞活性明显下降，说明肝细胞的增殖可能与GCS被抑制有关，推测抑制该酶后可能会导致神经酰胺水平升高，进而可能参与到肝细胞活性下降的过程中。

为了更深入研究GCS基因表达被抑制后引起肝细胞凋亡的可能机制，本研究进一步观察了转染UGCG siRNA后对肝细胞凋亡相关的Bcl-2凋亡途径的影响。作为抗凋亡基因，Bcl-2可与Bax形成二聚体，抑制细胞凋亡，而Bax水平增加可拮抗Bcl-2的作用，促进细胞凋亡[17]。此外，研究证实Bax在线粒体膜中形成Bax通道，促进细胞色素C释放并进入胞质，使Bcl-2与Apaf1分离后，继而激活Caspase，诱导细胞凋亡[18，19]。因此，Bcl-2 和 Bax在调控细胞凋亡过程中发挥重要作用。本研究发现抑制GCS基因表达后，可以导致Bcl-2基因水平显著降低，Bax基因水平升高，推测糖化神经酰胺和神经酰胺之间的代谢异常可能参与到Bcl-2和Bax调节的肝细胞凋亡过程中。另外，Caspase 3位于Caspase级联反应下游，是执行凋亡功能的最主要的蛋白酶之一[20]。本研究发现在抑制GCS基因表达后，Caspase 3基因水平明显上升，其蛋白表达有上升趋势，表明可能是由于凋亡相关基因表达改变后，最终引起执行凋亡效应的Caspase 3发生了变化，其蛋白水平上升不是非常明显，可能是由于效应时间较短的缘故。

总之，本研究在前期研究基础上，利用siRNA干扰技术体外转染肝细胞，初步发现GCS基因表达下降后，肝细胞增殖受到抑制，同时细胞凋亡增加，这种效应可能与Bcl-2介导的凋亡过程有关，是各种原因导致GCS发生变化后肝细胞凋亡的机制所在。