宫颈分泌物中Stat3和Survivin的测定在宫颈病变筛查中的价值

(常熟市第二人民医院妇产科，江苏 常熟 215500)

有85%的宫颈癌发生在包括中国在内的发展中国家，从宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)进展到宫颈癌需8～10年时间，在此时间窗内筛查出宫颈癌前病变并进行临床干预，可以有效预防宫颈癌的发生。根据中国子宫颈癌综合防控指南及中国子宫颈癌筛查及异常管理相关问题专家共识[1]，对中国适龄妇女进行规范化的细胞学和/或高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus，hr-HPV))检查初筛并进行合理分流可以避免更多女性罹患宫颈癌。但我国细胞学筛查的总体覆盖率仅21%，经济欠发达地区的基层医院细胞病理医生和分子实验医生短缺，筛查难以覆盖。鉴于目前中国的宫颈癌筛查现状，探索适合经济欠发达地区的筛查方法，提高经济欠发达地区的宫颈癌筛查覆盖率，对减少宫颈癌对经济欠发达地区女性生殖健康的威胁有着积极意义。本研究旨在探讨双抗体夹心法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 测定宫颈分泌物中信号转录与活化因子3(signal transcription and activation factor 3，Stat3)和生存素(Survivin)蛋白含量在宫颈病变筛查中的价值，为经济欠发达地区的宫颈病变筛查提供新方法。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年12月至2017年10月常熟市第二人民医院妇科门诊薄层液基细胞学(thinprep cytologic test，TCT)和/或hr-HPV初筛结果异常行宫颈活检的192例女性患者为研究对象，纳入标准：①已行TCT和/或hr-HPV检测；②无宫颈癌及癌前病变治疗史；③非经期取材；④72小时内无性生活、盆浴、阴道检查、阴道冲洗及局部上药史。

1.2方法

1.2.1宫颈分泌物标本采集

用新柏氏长柄宫颈刷刷取宫颈管分泌物，充分洗脱至新柏氏细胞保存液中，加组织蛋白萃取剂(裂解液)裂解细胞，4℃ 2 500转/分钟离心20分钟，取上清液，入-20℃冰箱保存备用。

1.2.2实验器材与试剂

主要实验器材为：洗板机、酶标仪、恒温箱、旋涡混合器。主要实验试剂为：人Survivin和Stat3 ELISA检测试剂盒，购自武汉博士德生物科技有限公司。

1.2.3 TCT及hr-HPV检测

TCT检查由本院病理科细胞学室副主任医师以上的专职医生阅片，采用2009年国际癌症协会的伯塞斯达系统(the Bethesda system，TBS)对其进行描述性诊断，以无明确诊断意义的不典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undermined significance，ASCUS)以上为细胞学结果异常。采用广东凯普生物科技股份有限公司的21种(HPV)分型检测试剂盒(PCR-膜杂交法)进行hr-HPV检测，14种hr-HPV病毒亚型为16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68，以任意1种及以上hr-HPV阳性为阳性。受医保政策和患者主观因素的影响，行TCT筛查共186例，TCT 结果异常 142例。hr-HPV筛查共154例，阳性132例；ASCUS患者36例全部行hr-HPV检测进行分流， hr-HPV 阳性26例。TCT+hr-HPV筛查共148例。

1.2.4宫颈活体组织活检病理检查

对符合阴道镜转诊指征的患者行阴道镜下宫颈多点活检组织病理学检查。宫颈活检组织病理检查结果为慢性宫颈炎41例，CIN1级56例，CIN2级28例，CIN3级53例，子宫颈原位癌及微小浸润癌16例(均为鳞癌)。以病理级别最高者作为组织学的最后诊断。

1.2.5 ELISA法检测Stat3和 Survivin蛋白含量

严格按照试剂盒说明对192例患者进行ELISA法Stat3和 Survivin蛋白含量测定。测Survivin和Stat3蛋白浓度分别为0.61～118.07pg/mL和0.037～0.353ng/mL，确定截断值分别为4.89pg/mL和0.040ng/mL。

1.2.6 结果判定

参照ACOG 2016年10月发布的子宫颈癌筛查指南[2]，二联筛查方案以Survivin、Stat3阳性/TCT ASCUS以上，Survivin、Stat3阴性/TCT LSIL以上，Survivin、Stat3阴性/HR-HPV16、18阳性，Survivin/Stat3双阳性，Survivin、Stat3阳性/其它12种hr-HPV阳性为阳性结果。三联筛查方案以Survivin、Stat3阴性/TCT阴性/HPV16、18阳性，Survivin、Stat3阳性/TCT ASCUS以上 /其它12种hr-HPV阳性，Survivin、Stat3阴性/TCT LSIL以上/HPV阴性或阳性，Survivin和Stat3双阳性/TCT阴性/hr-HPV阴性或阳性为阳性结果。以宫颈活检病理结果为诊断金标准，比较Survivin和Stat3单独及各种联合筛查方案及TCT、hr-HPV和TCT+hr-HPV用于宫颈病变筛查的效能。

1.3统计学方法

使用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计学分析。以宫颈活检病理结果为诊断金标准，病理诊断高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSILs) 及以上组(CIN 2级、CIN 3级、子宫颈原位癌及镜下早期浸润癌)为阳性组，低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSILs)及以下组(慢性子宫颈炎、CIN1级)为阴性组。计算Survivin和Stat3各单独和联合筛查方案及TCT、hr-HPV和TCT+hr-HPV方案筛查HSILs+的灵敏度、特异度、约登指数、一致率、阳性预测值与阴性预测值及其95%的可信区间(95%CI)。计数资料的比较采用χ2检验，当理论频数<1，n<40，P接近界值0.05时采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 Stat3、Survivin、hr-HPV单独和联合筛查方案效能比较

结果显示：①单独筛查方案中，Stat3方案的约登指数和一致率最高，筛查结果最为真实、可靠。②二联筛查方案中，Stat3+hr-HPV方案与Survivin+Stat3方案一致率和约登指数接近，明显高于其它二联筛查方案，筛查结果比其它二联筛查方案真实、可靠。③三联筛查方案中，Stat3+TCT+hr-HPV方案的约登指数和一致率最高，真实性和准确较其它三联筛查方案好，见表1。

表1 Stat3、Survivin、hr-HPV单独及联合筛查方案效能比较[%(n/N)]

Table 1 Comparison of efficacy of Stat3 and survivin separate and combined screening with efficacy of TCT,

hr-HPV and TCT+hr-HPV schemes[%(n/N)]

2.2 三种方案的灵敏度和特异度比较

Stat3方案与TCT和hr-HPV方案的灵敏度和特异度比较显示，3种方案的总体灵敏度差异无统计学意义(P>0.05)，总体特异度差异有统计学意义(P<0.05)。χ2分割法检验比较，Stat3方案的特异度显著高于TCT和hr-HPV方案(均P<0.05)，见表2和表3。

表2 Stat3方案与TCT和hr-HPV方案的灵敏度比较结果(n)

Table 2 Comparison of sensitivity of Stat3, TCT and

hr-HPV(n)

表3 Stat3方案与TCT和hr-HPV方案的特异度比较结果(n)

Table 3 Comparison of specificity of Stat3, TCT and

hr-HPV (n)

注：▲为三种方案的比较，★为Stat3与TCT比较，◆为Stat3与hr-HPV比较。

2.3 四种方案的总体灵敏度和特异度比较

Survivin+Stat3、Stat3+hr-HPV和Stat3+TCT+hr-HPV方案与TCT+ hr-HPV方案的灵敏度和特异度比较显示，4种方案的总体灵敏度差异无统计学意义(P>0.05)，总体特异度差异有统计学意义(P<0.05)。χ2分割法检验比较，Survivin+Stat3方案特异度显著高于TCT+hr-HPV方案(P<0.05)，Stat3+hr-HPV和Stat3+TCT+hr-HPV方案与TCT+hr-HPV方案比较特异度差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4和表5。Stat3+hr-HPV和Stat3+TCT+hr-HPV方案与TCT+hr-HPV方案比较约登指数(0.70/0.71/0.59)和一致率(84.42%/86.46%/79.73%)较好，筛查结果比TCT+hr-HPV方案真实、可靠。但这2种方案与Stat3方案比较， 灵敏度(95.95%/94.67%/92.40%)和特异度(73.75%/76.71%/73.00%)接近，增加了hr-HPV和TCT+hr-HPV检测费用，不符合卫生经济学要求，故两种方案并不能作为理想的宫颈病变联合筛查方案。通过比较、分析，筛选Stat3和Survivin+Stat3方案为单独和联合筛查方案，下面将对Stat3和Survivin+Stat3方案的筛查效能及分流ASCUS的效能进行进一步比较分析。

表44种方案的灵敏度比较结果(n)

Table 4 Comparison of sensitivity of survivin+Stat3, Stat3+hr-HPV, Stat3+TCT+hr-HPV and TCT+hr-HPV(n)

表54种方案的特异度比较结果(n)

Table 5 Comparison of specificity of survivin+Stat3, Stat3+hr-HPV, Stat3+TCT+hr-HPV and TCT+hr-HPV(n)

筛查方案 筛查结果 阳性阴性合计特异度(%) 95%CI 下限 上限Stat3+hr-HPV21598073.750.732 0.743Survivin+Stat316829883.670.833 0.840Stat3+TCT+hr-HPV 18567476.710.762 0.773TCT+hr-HPV26487464.860.641 0.656χ28.10▲/1.43★/8.08◆/2.07●P0.04▲/0.24★/0.02◆/0.18●

注：▲为4种方案的比较，★为Stat3+hr-HPV与TCT+hr-HPV比较，◆为Survivin+Stat3与TCT+hr-HPV比较，●为Stat3+TCT+hr-HPV与TCT+hr-HPV比较。

2.4 Stat3与Survivin+Stat3方案的灵敏度和特异度比较

Stat3与Survivin+Stat3方案灵敏度和特异度比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表6和表7。

表6 Stat3与Survivin+Stat3方案的灵敏度比较

结果(n)

Table 6 Comparison of sensitivity of Stat3 and survivin+Stat3(n)

筛查方案 筛查结果 阳性阴性合计灵敏度(%) 95%CI 下限 上限Stat38579292.400.922 0.926Survivin+Stat384109489.360.892 0.896χ20.51P0.49

表7 Stat3方案与Survivin+Stat3方案的特异度比较结果(n)

Table 7 Comparison of specificity of Stat3 and survivin+Stat3(n)

筛查方案 筛查结果 阳性阴性合计特异度(%) 95%CI 下限 上限Stat3277310073.000.726 0.735Survivin+Stat316829883.670.833 0.840χ23.32P0.08

2.5 Stat3和Survivin+Stat3方案与hr-HPV方案在ASCUS分流中的效能比较

3种分流方案的总体灵敏度差异有统计学意义(Fisher确切概率法检验，P=0.02)。Stat3方案与hr-HPV方案比较灵敏度差异无统计学意义(Fisher确切概率法检验，P=0.24)，Survivin+Stat3方案的灵敏度显著低于hr-HPV方案(Fisher确切概率法检验，P=0.049)，见表8。

3种分流方案的总体特异度差异有统计学意义(P<0.05)。Stat3与hr-HPV方案比较，特异度差异有统计学意义(P<0.05)，Survivin+Stat3方案与hr-HPV方案比较，特异度差异无统计学意义(P>0.05)，见表9。

表8 Stat3和Survivin+Stat3方案与hr-HPV方案

在ASCUS分流中的灵敏度比较结果(n)

Table 8 Comparison of sensitivity of Stat3 and survivin+Stat3 and hr-HPV in ASCUS triage(n)

注：▲为3种方案的比较，★为Stat3与hr-HPV比较，◆为Survivin+Stat3与hr-HPV比较；均为Fisher检验。

表9 Stat3和Survivin+Stat3方案与hr-HPV方案在ASCUS分流中的特异度比较结果(n)

Table 9 Comparison of specificity of Stat3 and Survivin+Stat3 and hr-HPV in ASCUS triage(n)

注：▲为3种方案的比较，★为Stat3与hr-HPV比较，◆为Survivin+Stat3与hr-HPV比较。

3讨论

3.1 Stat3和Survivin在宫颈癌发生中的作用

Survivin是一种凋亡抑制基因，与多种肿瘤的发生密切相关，本人研究发现Survivin 与亚洲人口CIN的进展有关[3]。另有研究发现Survivin 是hr-HPV持续感染的分子标记物，对宫颈癌和CIN的诊断有重要价值[4]， Survivin的表达量依赖于HPVE6/E7 的持续性表达, 沉默HPV E6/E7 基因的表达可使Survivin表达下调[5]。Stat3是一种原癌蛋白，磷酸化的Stat3(phosphorylation of Stat3，p-Stat3)具有生物学功能。Stat3通过控制干细胞的自我更新，造成HPVE6癌蛋白选择性地过表达，促进子宫颈癌发生[6]。研究发现宫颈癌细胞株及宫颈癌组织中均存在p-Stat3的表达上调，并伴有下游凋亡抑制基因survivin的表达上调， 用Jak2 特异性抑制剂AG490抑制Stat3活化可造成survivin的表达下调[7]。Shirish等[8-9]研究发现Stat3的持续性活化与HPV阳性宫颈癌的发生密切相关，抑制 Stat3的表达或活化可使HPV阳性细胞株 E6和 E7 基因表达抑制，宫颈癌细胞株失活。通过以上研究，可以明确Stat3和Survivin在HPV阳性宫颈癌的发生、发展过程中可能起协同作用，其作用机制为Stat3的持续性活化导致了hr-HPV的持续性感染，HPVE6/E7过表达，启动致癌过程，Survivin表达上调，细胞异常增殖，上皮病变进展为CINⅡ～Ⅲ级，最终导致了子宫颈癌的发生。这为检测宫颈脱落细胞中Stat3和Survivin蛋白用于宫颈病变筛查提供了理论依据。

3.2 Stat3和Survivin在宫颈病变筛查中的价值

ELISA法为最广泛应用的临床疾病诊断检测方法之一，快速、灵敏、简便、载体易于标准化，实验技术人员无需特殊培训，可在经济欠发达地区的基层医院推广使用，可从一定程度上弥补经济欠发达地区基层医院细胞病理医生缺乏的局限性，并作为临床宫颈疾病筛查一项重要的辅助检查。2010年，张蕴霞等研究发现检测宫颈分泌物中Survivin蛋白含量用于宫颈癌筛查的灵敏度(85.0%)与TCT(83.3%)比较无差异，特异度(97.8%)明显高于TCT(76.1%)，认为检测宫颈分泌物中Survivin含量是一种比较好的宫颈癌辅助诊断方法。王冰玉[10]研究发现ELISA法测定宫颈分泌物中Survivin蛋白含量联合TCT检查诊断宫颈高级别病变的灵敏度为96.77%，特异度为75.51%，高于TCT和HPV联合筛查(93.55%和22.45%)。

本研究结果显示， Stat3方案的筛查效能高于Survivin，与TCT和hr-HPV方案比较筛查HSILs+的灵敏度差异无统计学意义(P>0.05)，特异度显著高于TCT和hr-HPV方案(P<0.05)，且约登指数、一致率和阳性预测值均高于TCT和hr-HPV方案(P<0.05)，误诊率和阴道镜转诊率比TCT降低32.55%和13.21%，比hr-HPV降低47.36%和19.83%。说明 Stat3方案比TCT和hr-HPV方案筛查结果真实、可靠，可以有效降低误诊率，减少不必要的阴道镜转诊。Stat3方案用于ASCUS分流筛查HSILs+的灵敏度虽低于hr-HPV方案(P>0.05)，但有良好的特异度和阳性预测值，能降低33.33%的误诊率和16.35%的阴道镜转诊率，比hr-HPV用于ASCUS分流效能更高，有望作为新的ASCUS分流方案。Survivin+Stat3方案与TCT+hr-HPV方案比较，筛查HSILs+的灵敏度差异无统计学意义(P>0.05)，灵敏度、约登指数、一致率和阳性预测值高于TCT+hr-HPV方案，筛查结果比TCT+hr-HPV方案真实、可靠，误诊率和阴道镜转诊率比TCT+hr-HPV方案降低18.90%和11.08%，简单、经济、易于普及，有望作为新的宫颈病变筛查方案。Survivin+Stat3方案在ASCUS分流中虽特异度高于hr-HPV方案，但灵敏度低(66.67%)，作为ASCUS分流方案漏诊率高(33.33%)，故不宜作为ASCUS分流方案。

Stat3单独筛查方案灵敏度(92.40%)略高于Survivin+Stat3联合筛查方案(89.36%)，但特异度(73.00%)、约登指数(0.65)、一致率(82.29%)和阳性预测值(75.89%)均低于Survivin+Stat3联合筛查方案，说明Survivin+Stat3联合筛查方案结果比Stat3单独筛查方案更真实、可靠，效能更高。Stat3单独筛查方案灵敏度(92.40%)和阴性预测值(91.25%)高，漏诊率低，能为筛查结果阴性的患者提供比较可靠的安全筛查间隔，适合用于宫颈病变筛查，Survivin+Stat3联合筛查方案特异度(83.76%)和阳性预测值(84.00%)好，误诊率和阴道镜转诊率低，适合用于宫颈病变诊断。

考虑到我国经济欠发达地区细胞学筛查和hr-HPV筛查难以覆盖的现状、患者的经济承受能力和筛查方案在不同地区推广的可行性， 认为Stat3方案适合于经济欠发达地区的宫颈病变筛查和ASCUS分流， Survivin+Stat3方案适合于经济欠发达地区的宫颈病变诊断。

如本研究筛查方案能作为宫颈癌筛查策略用于经济欠发达地区和人群的宫颈病变筛查和诊断，有可能会增加经济欠发达地区的宫颈癌筛查覆盖率，提高经济欠发达地区的宫颈癌筛查效能，减少误诊和不必要的阴道镜转诊，有望逐渐减小宫颈癌对发展中国家女性健康的威胁。