马氏珠母贝群体不同生长阶段类胡萝卜素含量与基因表达量比较

王姿曼，李 燕，雷 超，李俊辉，王庆恒,2，邓岳文,2

( 1.广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088； 2.广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心，广东 湛江 524088 )

类胡萝卜素是一类广泛分布在动物、植物、微生物中的脂类色素，主要分为β和γ两种类型。动物体内类胡萝卜素具有抗氧化作用，并能提高免疫力、预防癌变、维持机体正常生长需要和改善繁殖和着色等[1-2]。类胡萝卜素代谢是一个复杂的生理过程，涉及多种蛋白，如载脂蛋白(PmAPOL3)、清道夫受体B(PmSR-B)及stAR 相关脂质转运蛋白-3 类似蛋白(PmSTARDL3)[3-6]。

贝类体内含有类胡萝卜素，且类胡萝卜素含量与体色有关，如华贵栉孔扇贝(Chlamysnobilis)橙色壳的个体类胡萝卜素总量显著高于褐色壳的个体[7]。虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)橙色闭壳肌与类胡萝卜素的累积有关[8]。珍珠贝体内也含有类胡萝卜素，珍珠颜色可能与贝类体内的类胡萝卜素含量有关。将适量 β-胡萝卜素添加到养殖水体中，可提高三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)外套膜中类胡萝卜素含量，并促使珍珠碳酸钙文石有序的结晶从而有效改善其光泽[9]。在三角帆蚌的珍珠层中，紫色区域的类胡萝卜素含量显著高于白色区域，这表明贝类珍珠层的颜色形成与类胡萝卜素的代谢之间有一定的相关性[10]。

马氏珠母贝(Pinctadafucatamartensii)分布于我国南方广东、广西、海南等多地的沿海区域，主要用于培育海水珍珠。马氏珠母贝壳色包括黑色、红色、黄色和白色，前期的研究表明，金黄壳色群体的类胡萝卜素含量大于普通养殖群体[5,11]。笔者以马氏珠母贝金黄壳色选育群体与普通养殖群体为试验材料，在不同生长阶段进行取样，比较两个群体类胡萝卜素含量与类胡萝卜素代谢基因差异，以期了解马氏珠母贝类胡萝卜素代谢的生理基础，同时为遗传育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以金黄壳色第4代选育群体为研究对象，其亲本来源于第3代金黄壳色选育群体[12]，自第3代金黄壳色选育群体选取亲本，雌、雄亲本数量分别为50个与48个；养殖群体来源于基础群体，选取等数量的雌、雄亲本；解剖性腺，人工授精，按照常规技术进行幼体培育与海区养殖。

在4月龄，从选育群体与养殖群体分别取样20个个体，提取全组织用于检测两个群体类胡萝卜素含量差异；在8、18月龄时，分别自两个群体取样20个个体，剪取鳃、外套膜、闭壳肌和肝胰腺组织，用于检测两个群体各组织类胡萝卜素含量与类胡萝卜素代谢相关基因表达量分析。

1.2 方法

类胡萝卜素的测定方法参照文献[13]，具体如下：称取0.1 g样品研磨成粉末状，放入10 mL试管中，加入分析纯丙酮5 mL，室温下暗处200 r/min振荡提取2 h，5000 r/min离心5 min，取上清液，提取两次，合并两次的丙酮提取液，于480 nm处测定丙酮提取液的吸光值。

基于转录组数据，选取了PmAPOL3、PmSR-B及PmSTARDL3共3个基因进行表达量分析。引物序列见表1。利用Trizol试剂提取各组织总RNA用于荧光定量PCR。以GAPDH为内参，普通养殖群体闭壳肌基因表达量为对照，通过 2-ΔΔCT计算法得出PmSR-B、Pm-APOL3、PmSTARDL3基因在鳃、外套膜、闭壳肌和肝胰腺的相对表达量。

表1 用于荧光定量分析的引物序列

1.3 数据处理

利用t检验分析比较不同生长阶段两个群体的类胡萝卜素含量与基因相对表达量的差异。利用SPSS 19.0 软件进行统计分析，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 4月龄两个群体类胡萝卜素含量差异分析

4月龄两个群体类胡萝卜素含量比较见图1。由图1可见，两个群体的类胡萝卜素含量差异不显著(P>0.05)。

图1 在4月龄选育和对照两个群体类胡萝卜素含量比较 不同字母均值差异显著(P<0.05).下同.

2.2 两个群体各组织类胡萝卜素含量差异

t检验结果表明，在 8月龄金黄壳色选育群体肝胰腺、鳃、外套膜与闭壳肌类胡萝卜素含量均显著高于养殖群体同组织(P<0.05)(图2)；在18月龄金黄壳色选育群体肝胰腺、闭壳肌与鳃的类胡萝卜素含量大于养殖群体，然而养殖群体外套膜的类胡萝卜素含量大于金黄壳色选育群体(图3)。

图2 8月龄两个群体不同组织类胡萝卜素含量比较 注：不同字母示均值差异显著(P<0.05).图3～图9同.

图3 18月龄两个群体不同组织类胡萝卜素含量比较

2.3 两个群体中类胡萝卜素含量与相关基因表达量差异分析

t检验结果表明，8月龄金黄壳色选育群体肝胰腺、闭壳肌、外套膜与鳃PmSR-B、PmAPOL3与PmSTARDL3基因表达量均大于养殖群体肝胰腺、闭壳肌、外套膜与鳃，其中肝胰腺PmSTARDL3基因表达量显著大于养殖群体肝胰腺(P<0.05)(图4～图6)；18月龄金黄壳色选育群体肝胰腺、闭壳肌与鳃的PmSR-B、PmAPOL3与PmSTARDL3基因表达量显著大于养殖群体的肝胰腺、闭壳肌与鳃(P<0.05)，然而养殖群体外套膜PmSR-B、PmAPOL3与PmSTARDL3基因表达量显著大于金黄壳色选育群体(P<0.05)(图7～图9)。

图4 8月龄PmSR-B的相对表达量

图5 8月龄PmAPOL3的相对表达量

图6 8月龄PmSTARDL3的相对表达量

图7 18月龄PmSR-B的相对表达量

图8 18月龄PmAPOL3的相对表达量

图9 18月龄PmSTARDL3的相对表达量

3 讨 论

贝类类胡萝卜素分布具有组织特异性。有研究表明，虾夷扇贝各组织类胡萝卜素含量存在差异，含量高低依次为性腺、鳃、外套膜、闭壳肌[14]；淡水珍珠贝三角帆蚌各组织类胡萝卜素存在明显差异，肝胰腺中类胡萝卜素含量显著大于性腺、边缘膜、鳃丝及中央膜[10]。本研究中检测马氏珠母贝的不同组织类胡萝卜素含量差异，结果表明，不同生长阶段各组织类胡萝卜素含量存在明显差异，其中肝胰腺的类胡萝卜素含量明显大于鳃、闭壳肌与外套膜。这也与之前的研究结果[13]一致，且肝胰腺类胡萝卜素代谢相关基因(如PmSR-B、PmAPOL3和PmSTARDL3)表达量明显大于其他组织，这进一步证明肝胰腺是马氏珠母贝类胡萝卜素转运、吸收和代谢的主要器官。

贝类体内的类胡萝卜素含量受到贝龄、发育阶段与性别等因素的影响[7]。通过比较贝龄对华贵栉孔扇贝各组织类胡萝卜素含量影响，结果表明，4月龄和16月龄的个体相比，闭壳肌和外套膜中的类胡萝卜素含量均无显著差异，但16月龄雌性与雄性个体的性腺组织的类胡萝卜素含量均显著高于4月龄个体。通过比较马氏珠母贝个体规格对各组织类胡萝卜素含量影响发现，大规格与小规格群体的鳃、肝胰腺、闭壳肌、外套膜边缘膜与外套膜中央膜的类胡萝卜素含量差异不显著(P>0.05)，大规格群体各组织的类胡萝卜素含量略大于小规格群体[13]。本研究表明，不同生长阶段的马氏珠母贝体内的类胡萝卜素含量存在明显差异，这可能与贝类生活的季节有关。

类胡萝卜素是脂溶性物质，在动物体内的消化、转运与吸收代谢过程中，需要多种蛋白质的参与。食物中的类胡萝卜素与蛋白质结合，进入动物体内后在消化酶的作用下将其分离出来，在消化道十二指肠乳化形成乳糜微粒，然后通过脂蛋白等载体转运或被动扩散吸收[2]。果蝇的类胡萝卜素在转运的过程中首先需要结合高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，形成类胡萝卜素蛋白复合物，该复合物被位于细胞膜上的清道夫受体所识别，通过进一步介导进入细胞内，因此清道夫受体在组织细胞吸收类胡萝卜素的过程中起着关键性的作用[3]。与其他生物比较，马氏珠母贝类胡萝卜素代谢基础研究较少。基于前期转录组数据分析，筛选马氏珠母贝类胡萝卜素代谢相关基因，并验证了部分基因的功能。马氏珠母贝载脂蛋白PmAPOL3基因在外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺等组织中均有表达，其中肝胰腺表达量最高[4]；马氏珠母贝PmSR-B基因具有典型的CD36 结构域，PmSR-B基因在肝胰腺的表达量最高[5]。PmSTARDL3属于类固醇急性调节蛋白家族，具有PmSTARDL3特有的结构域START结构域，PmSTARDL3与胆固醇、类固醇和脂类的物质的合成与代谢相关[6,14]。雷超等[6]检测了马氏珠母贝PmSTARDL3组织分布特性，PmSTARDL3基因在肝胰腺表达量最高。本研究利用转录组数据筛选了3个类胡萝卜素代谢相关基因，比较两个群体各组织的基因表达量差异，而且这种差异与各组织类胡萝卜素含量存在正相关性，这也证明了这3个基因参与了马氏珠母贝类胡萝卜素的代谢过程。

贝类体内的类胡萝卜素受到遗传因素的影响，不同壳色个体的类胡萝卜素含量存在明显差异。例如虾夷扇贝橘红色闭壳肌所含的类胡萝卜素高于普通的白色闭壳肌[8]，华贵栉孔扇贝橙色闭壳肌个体的类胡萝卜素含量是白色闭壳肌个体4.7～13.7倍，而且这种橘红色或橙色闭壳肌富含的类胡萝卜素能够稳定地遗传，通过家系选择能明显提高子代个体的类胡萝卜素[16]。不同类胡萝卜素含量的马氏珠母贝家系的高温胁迫免疫反应试验表明，类胡萝卜素能增强马氏珠母贝的抗氧化系统，可作为选育抗逆品系的育种指标[17]。本研究结果表明，金黄壳色选育群体的类胡萝卜素含量大于养殖群体，植核手术后金黄壳色群体成活率显著大于养殖群体，而且金黄壳色选育群体的酚氧化酶、溶菌酶、亮氨酸氨基肽酶与超氧化物歧化酶等免疫酶活力指标均显著大于养殖群体，这与Meng等[17]的研究结果一致。