不同类型硒对黑鲷幼鱼生长及血清免疫指标的影响

2018-09-20陈星灿相兴伟周宇芳邵庆均肖金星

水产科学 2018年5期

陈星灿，王磊，相兴伟，周宇芳，邵庆均，郑斌，肖金星

( 1.浙江大学舟山海洋研究中心，浙江舟山 316021； 2.舟山市定海区人民政府马岙街道办事处，浙江舟山 316000； 3.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058； 4.浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316021 )

硒为谷胱甘肽过氧化物酶和含硒tRNA的组成成分，能防止过氧化物在细胞内蓄积，保护细胞免受损伤，也能促进某些mRNA翻译蛋白质的过程，提高机体的免疫力与抗病力，促进动物的生长[1-2]，是水产动物正常生长和生理功能所必需的重要微量元素，在水产动物的营养研究中逐渐受到重视。有关水产动物对硒的需求量已有诸多研究。万敏等[3]的研究表明，当饲料中含有50 IU/kg的维生素E时，添加约0.6 mg/kg的硒能使皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)血清中的抗氧化酶系统达到相对平衡，使动物能有效地抵抗氧化损害。Lin等[4]以质量增加率和硒的留存率为指标研究发现，点带石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)幼鱼对饲料中硒的最适需求量为0.7 mg/kg。从提高免疫力和抗病力的角度出发，张琴等[5]建议仿刺参(Apostichopusjaponicus)饲料中同时添加硒酵母600 mg/kg和维生素E 250 mg/kg。Lin等[6]研究了饲料中添加有机硒和无机硒对石斑鱼幼鱼生长和肉质等的影响，发现石斑鱼幼鱼对硒代蛋氨酸和亚硒酸钠的最适需求量分别为0.98 mg/kg和0.9 mg/kg。

常见的硒分为有机硒和无机硒两种形式，用于饲料中的无机硒主要为亚硒酸钠，有机硒主要为硒化多糖和硒代蛋氨酸。不同化学形式硒的生物利用率明显不同[7-8]。众多研究表明，有机硒比无机硒具有更高的生物利用率，例如更高的硒保留率、消化率以及更低的毒性[9-10]。硒化多糖作为一种有机硒化合物，兼有多糖与硒二者的活性，为生物体内无机硒转化成有机硒的有效形式之一，生物活性普遍高于多糖和硒，更易于为机体吸收和利用[11]。硒化多糖可以作为增强适应性免疫性能的潜力含硒膳食补充剂[12]。

黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)是我国东南沿海地区及日本、韩国、东南亚等国家和地区海水养殖的名贵经济鱼类[13-14]。目前，关于黑鲷对蛋白和氨基酸的需求量、饲料中鱼粉替代蛋白源开发等已有研究[15-17]，但关于黑鲷对硒的利用研究较少，且针对黑鲷对有机硒和无机硒吸收及利用比较的研究更少。笔者研究了饲料中添加外源有机硒和无机硒对黑鲷幼鱼生长性能、体组成及血清免疫指标的影响，旨在为黑鲷饲料免疫增强剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 饲养试验

黑鲷幼鱼由浙江省海洋水产研究所试验场提供。经过14 d的暂养后，停饲1 d，挑选体质健康、大小均匀、初始体质量为(13.00±0.20) g的黑鲷幼鱼随机分为3组，每组3个重复，每个重复25尾，放入容积为310 L(水体260 L)的玻璃纤维缸内，微流水式饲养8周。海水经沉淀、过滤后使用，流速控制在2 L/min，平均水温为(27±1) ℃，盐度26～29，溶解氧>5.0 mg/L。养殖期间，每日8:00和16:00投喂至饱食状态，记录各试验组投饵量和死亡率。

1.2 饲料配方

基于前期黑鲷饲料营养需求研究结果，设计试验基础饲料(对照组)蛋白水平为41.57%，脂肪为13.63%。在基础饲料中分别添加2.35 mg/kg的硒化多糖和0.88 mg/kg的亚硒酸钠，使试验饲料中外源硒的添加量均为0.4 mg/kg。硒化多糖为自制，通过壳聚糖与亚硒酸钠螯合而成，分子量为50 ku，硒含量的实测值为17%。亚硒酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，硒含量≥63.8%。饲料原料粉碎过80目筛，充分混合均匀后，制成粒径为2.5 mm的硬颗粒饲料，用空调抽湿、风扇干燥72 h，置于-20 ℃冰柜中保存备用[15]。各组试验饲料配方及营养成分值见表1。

1.3 样品采集及分析测定

56 d养殖试验结束时，将试验鱼饥饿24 h，用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐60 mg/L麻醉，记录每缸试验鱼数目，测量体长、体质量。每缸取3尾鱼用作全鱼分析。剩余试验鱼尾静脉取血，置于离心管中，4 ℃静置2 h，3000 r/min 离心15 min，取上层血清，于-20 ℃冰箱中保存；取血后将试验鱼置于冰盘上解剖，去除鱼皮后，取两侧侧线上的背肌，将样品置于-20 ℃的冰箱中保存；取出试验鱼内脏团，剥离其上附着的脂肪组织，将肝脏称量质量后，置于-20 ℃的冰箱中保存，待分析用。

全鱼常规营养成分测定方法如下：粗蛋白采用GB 6432—94方法；粗脂肪采用GB 6433—94的方法；水分采用GB 6435—86的方法；灰分采用GB 6438—92的方法。血清中血清免疫球蛋白M、补体C3、补体C4的活力采用南京建成试剂盒检测。

1.4 生长指标计算方法

成活率/%=n2/n1×100%

特定生长率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

肝体比/%=m3/m×100%

肥满度=m/L3×100

式中，n1为试验初始时鱼的尾数，n2为试验结束时鱼的尾数，m1为试验初始时鱼的平均体质量(g)，m2为试验结束时鱼的平均体质量(g)，m3为试验鱼的肝脏质量(g)，m为试验鱼体质量(g)，t为试验时间(d)，L为试验鱼体长(cm)。

表1 试验饲料原料组成及营养成分含量 g/kg

注：1.复合维生素(mg/kg)：α-生育酚，20；二硫氢酸钠维生素K，5；维生素B1，5；泛酸钙，10；烟碱酸，100；维生素B6，5；叶酸，2；维生素B12，0.05；生物素，0.5；氨基苯酸，50；肌醇，500；氯化胆碱，500；维生素C，150；维生素A，10 000 IU/kg；维生素D3，2000 IU/kg. 2.复合矿物盐(mg/kg)：Na2SiO3, 0.4; CaCO3, 544.9; NaH2PO4·H2O, 200; KH2PO4, 200; MgSO4·7H2O, 10; MnSO4·H2O, 4; CuCl2·2H2O, 2; ZnSO4·7H2O, 12; FeSO4·7H2O, 12; NaCl, 12; KI, 0.1; CoCl2·6H2O, 0.1; Na2MoO4·2H2O, 0.5; AlCl3·6H2O, 1; KF, 1.

1.5 数据处理

本试验结果数据均采用平均值±标准差表示，用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析后采用Duncan多重比较检验，显著水平为0.05。

2 结果

2.1 外源硒对黑鲷幼鱼生长性能及形体指标的影响

经过8周的饲养试验，各组黑鲷幼鱼成活率均超过98%，饲料中添加硒化多糖和亚硒酸钠对黑鲷幼鱼的成活率、肝体比和肥满度无显著影响(P>0.05)，而添加硒化多糖和亚硒酸钠的试验组黑鲷幼鱼的特定生长率均显著高于对照组(P<0.05)；添加硒化多糖组黑鲷幼鱼的特定生长率显著高于添加亚硒酸钠组(P<0.05)(表2)。

2.2 外源硒对黑鲷幼鱼全鱼常规营养组成的影响

饲料中添加硒化多糖和亚硒酸钠组黑鲷幼鱼全鱼的蛋白、脂肪、水分以及灰分含量与对照组相比，均差异不显著(P>0.05)(表3)。

2.3 外源硒对黑鲷幼鱼血清免疫指标的影响

饲料中添加硒化多糖和亚硒酸钠组黑鲷幼鱼血清免疫球蛋白M、补体C3、补体C4的含量均显著高于对照组(P<0.05)，且添加硒化多糖组黑鲷幼鱼的血清免疫球蛋白M、补体C3、补体C4的含量显著高于添加亚硒酸钠组(P<0.05)(表4)。

表2 外源硒对黑鲷幼鱼生长性能及形体指标的影响

注：结果用平均值±标准差表示(n=3)，同列肩注不同字母者，表示差异显著(P<0.05)，下同.

表3 外源硒对黑鲷幼鱼全鱼常规营养组成的影响 %

表4 外源硒对黑鲷幼鱼血清免疫指标的影响

2.4 外源硒对黑鲷幼鱼肌肉和肝脏组织硒含量的影响

饲料中添加硒化多糖和亚硒酸钠组黑鲷幼鱼肌肉和肝脏组织中硒含量均显著高于对照组(P<0.05)，添加硒化多糖的黑鲷幼鱼肌肉和肝脏组织硒含量显著高于添加亚硒酸钠组(P<0.05)，肝脏中硒含量显著高于肌肉中硒含量(P<0.05)(表5)。

表5 外源硒对黑鲷幼鱼肌肉和肝脏组织硒含量的影响mg/kg

3 讨论

3.1 外源硒对黑鲷幼鱼生长的影响

硒是鱼类保持正常生长发育所必需的微量元素，缺硒会抑制鱼体生长[18]。目前有关添加外源硒对水产动物的促生长效果已开展诸多研究。王安利等[19]研究表明，饲料中添加外源硒可以显著促进中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)的生长。华雪铭等[20]在饲料中添加0.3%、0.6%和1.2%的硒酵母，使异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)体质量增加率显著高于对照组。Lin等[4]研究表明，饲料中添加适量的硒代蛋氨酸，石斑鱼幼鱼的体质量增加率显著高于对照组，硒水平为0.77 mg/kg时达最大值。梁萌青等[21]研究表明，在饲料中添加亚硒酸钠可以显著提高花鲈(Lateolabraxjaponicus)的特定生长率，硒水平为0.4 mg/kg时达到最大值。许友卿等[22]在鳡鱼(Elopichthysbambusa)湿颗粒饲料中添加0～1.2 mg/kg的酵母硒，当酵母硒的添加量为0.6 mg/kg时，鳡鱼的质量增加率、特定生长率达到最大值。

3.2 外源硒对黑鲷幼鱼血清免疫指标的影响

鱼类的免疫系统执行免疫功能时受到营养物质的调控[31]。免疫球蛋白是具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，也是鱼类免疫系统的重要组成部分。传统的观点认为硬骨鱼类只有1种免疫球蛋白，类似于哺乳动物的免疫球蛋白M[32]，但近年来的研究结果表明，硬骨鱼可能有4类免疫球蛋白，分别是免疫球蛋白M[33]、免疫球蛋白D[34]、免疫球蛋白Z/T[35-36]以及免疫球蛋白M-Z[37]。Feng等[38]研究表明，B族维生素能够通过提高建鲤(Cyprinuscarpiovar. Jian)血清中嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)抗体效价和免疫球蛋白M水平从而增强其特异性免疫力。本试验中，饲料中添加硒含量为0.4 mg/kg的硒化多糖和亚硒酸钠组黑鲷幼鱼血清免疫球蛋白M含量显著高于对照组；添加硒化多糖组显著高于添加亚硒酸钠组。试验结果表明，添加外源硒可以提高黑鲷幼鱼免疫球蛋白M水平，增强其特异性免疫，且有机硒的效果优于无机硒。

鱼类补体大约由30余种蛋白裂解酶、酶抑制因子和受体构成，是机体内最为复杂的限制性蛋白溶解系统[39]。许多研究表明，鱼类补体直接参与机体防御，其生物学活性影响机体抵抗微生物的能力、免疫反应细胞间的通讯联系、免疫复合物的形成和持续时间等[40]。鱼类补体或免疫球蛋白对外界病原微生物的调理作用导致吞噬细胞吞噬活性增强。虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和鳗鲡(Anguillajaponica)补体激活后能产生导致白细胞发生趋化性的因子[41]，虹鳟的补体C5a也可引起头肾细胞的呼吸爆发[42]。补体缺失则会导致机体的非特异性免疫能力下降[43-44]。血清中不存在补体溶血活性的虹鳟和马苏大麻哈鱼(Oncorhynchusmasou)幼鱼更易感染传染性造血器官坏死病和传染性胰坏死病[45]。彭耀宗等[46]研究发现，摄食盐酸小檗碱的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)血清中补体C3含量和肝脏补体C3 mRNA表达量均显著增加，存活率显著高于对照组。本试验中，饲料中添加硒含量为0.4 mg/kg的硒化多糖和亚硒酸钠时，黑鲷幼鱼血清补体C3、补体C4含量显著高于对照组，添加硒化多糖组显著高于添加亚硒酸钠组，表明添加外源硒可以提高黑鲷幼鱼血清补体C3、补体C4水平，增强其非特异性免疫，且有机硒的效果优于无机硒。