牡丹籽油及植物提取物的降血糖降血脂活性

苏建辉 ， 张 玉 ， 刘成祥 ， 马朝阳 ， 聂荣京 ， 高传忠 ， 王洪新 *

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.盐城工学院 海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051；3.国家功能食品工程技术研究中心，江南大学，江苏 无锡214122；4.铜陵瑞璞牡丹产业发展有限公司，安徽 铜陵244000）

糖尿病是一种普遍的代谢紊乱症，由胰岛素分泌缺陷或胰岛素敏感性降低引起，导致碳水化合物、脂类和蛋白质代谢障碍[1]。心脑血管疾病在世界范围内逐年增长，降低胆固醇水平可以减少这种疾病的发病率[2]。药用植物在一些国家已经控制了糖尿病和高血脂[3-5]，成为安全有效降糖和降血脂药物的主要来源。此外已经从这些药用植物中取得降血糖降血脂的功能性成分，例如，黄酮、皂甙、生物碱、多糖和不饱和脂肪酸等[6]。植物源的天然产物相比于合成产物，被认为是毒性更小或者没有副作用。多年来，这些植物已经被用于治疗医学上的各种疾病。虽然一些传统中药或者提取物的降糖效果已经被报道，但是复方降血糖效果很少被研究。正交t值法目前已被用于中药主要成分研究[7-12]。目前已有很多天然产物被报道了对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、胆固醇酯酶和胰脂肪酶4种酶及胆固醇胶束溶解度的抑制效果。作者以5个指标的抑制率为评价指标，用正交t值法研究各功能因子的主要成分，加权综合的方法分析协同效应，D值优化法确定复方配比。从天然产物中寻找对消化酶具有抑制活性的功能因子，为辅助治疗高血糖、高血脂保健食品的配方研发提供现代科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物提取物 银杏黄酮（95%）、EGCG、槲皮素、绞股蓝皂甙、丹皮酚、魔芋多糖、葛根素纯度为98%；枸杞多糖、玉竹多糖和苦瓜提取物 （苦瓜素）纯度为80%以上，均购于南京景竹生物科技公司。牡丹籽油：铜陵瑞璞牡丹产业发展有限公司产品。1.1.2 实验试剂 可溶性淀粉、3，5-二硝基水杨酸、酚酞、橄榄油、麦芽糖、对硝基苯-β-D半乳糖吡喃 糖 苷 （p-Nitrophenyl α -D-glucopyranoside，PNPG）、95%乙醇、磷酸二氢钾、氢氧化钠、丙三醇均为国药集团分析纯；α-葡萄糖苷酶、猪胰脂肪酶、α-淀粉酶、胆固醇脂肪酶购于西格玛公司。

1.2 实验方法

1.2.1 α-淀粉酶活性抑制体系 取 50 μL α-淀粉酶（2 U/mL）和一定浓度抑制剂溶液，在37℃孵化10 min，加入质量分数0.75%可溶性淀粉1 mL，37℃反应5 min后加入1 mL DNS试剂，沸水浴5 min，迅速冷却后，稀释至适当倍数在520 nm波长测定吸光度（拜糖平为阳性对照）[3]。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶活性抑制体系 取PNPG 100 uL（10 mmol/L）加入 850 uL 磷酸缓冲液（PH 6.8）。再加入样品溶液，空白对照（不加酶的反应体系）以消除PNPG本身氧化产生对硝基苯酚（PNP）而影响测定结果。37℃孵化10 min，加入酶50 uL（2 U/mL），再孵化 50 min，加入 1 mL Na2CO3终止反应。405 nm测吸光度（拜糖平为阳性对照）。

1.2.3 胰脂肪酶活性抑制体系 取50 mL三角瓶数个，每瓶加入5 mL 0.025 mol/L磷酸缓冲液和 1 mL橄榄油作为底物，置于40℃水浴保温5 min，然后在瓶中（除空白外）各加入 50 μL酶液（5×100-400 U/mL），从加入脂肪酶开始精确计算时间，反应5 min后，立即加入体积分数95%乙醇15 mL，终止酶反应，再加1%酚酞2～3滴，用0.025 mol/L氢氧化钠滴定至淡红色（胰脂肪酶为阳性对照）[14]。

1.2.4 胆固醇酯酶反应体系 对胆固醇酯酶的抑制活性测试，测试温度保持在（25.0±0.2）℃。所有的反应在含有NaCl（0.1 mol/L）、对硝基苯基丁酸酯（4-Nitrophenyl butyrate，PNPB 0.2 mmol/L）、牛磺胆酸钠 （5.16 mmol/L）的磷酸钠缓冲液 （0.1 mol/L，pH 7.0）中进行。胆固醇酯酶预先溶解在高纯水中20 ug/mL；底物PNPB和抑制剂预先溶解在乙腈中，在-20℃保存。加入猪胰腺胆固醇酯酶（0.72 U/mL）启动反应，25.0℃反应5 min，在405 nm紫外可见分光光度计检测[15]。

1.2.5 胆固醇胶束溶解度反应体系 1 mL胶束溶液中含有 10 mmol/L牛磺胆酸钠，2 mmol/L胆固醇，5 mmol/L 油酸，132 mmol/L 氯化钠，15 mmol/L磷酸缓冲液 （pH 7.4）。超声波均质进行制备。37℃隔夜静置。将空白对照，一定量的功能因子分别加入到胶束溶液中，然后将混合溶液在37℃振荡培养 2 h，并在 16 000 r/min离心 20 min，收集上清液用试剂盒测定胶束中胆固醇含量[16]。

1.2.6 正交t值法-主药分析 将筛选出来的功能因子每种为一个因素，随机命名为A、B、C、D、E等。分别是茶多酚、银杏黄酮、牡丹籽油、绞股蓝皂甙和苦瓜提取物。每个因素设2水平，水平1为添加，水平2为不添加。根据功能因子对应α-淀粉酶和胆固醇酯酶IC50确定其在每组方中的比例用量。实验选用L12（211）正交t值表进行；各组通过对α-淀粉酶和胆固醇酯酶活性的抑制效果（0.5 mg/mL），加权综合确定主成分（1∶1），数据越大，作用越强。通过数据分析找出主药和辅药。

1.2.7 辅药交互作用 用正交t值和加权综合分析方法（1∶1）分析辅药和主药及辅药之间的相互作用，以功能因子对α-淀粉酶和胆固醇酯酶的活性抑制效果为检测指标。

1.2.8D值优化法剂量配比 以各功能因子对α-淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶和胆固醇酯酶的IC50为剂量选择依据，适当增减。计算质量浓度为0.5 mg/mL时功能因子不同剂量配比对α-淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶和胆固醇酯酶的抑制率。值越大，配比效果越好，选出最优配比[17]。

2 结果与分析

2.1 功能因子对消化酶和胆固醇胶束溶解度抑制率体外研究

以0.5 mg/mL抑制剂对胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶、胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度的抑制效果为评价标准。由图1可以看出EGCG对α-淀粉酶、胰脂肪酶和胆固醇胶束溶解度的抑制效果最好，达到95%、93%和100%。苦瓜提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果最好为87%。槲皮素对胆固醇酯酶的抑制效果最好，为92%。丹皮酚和枸杞多糖虽然对α-葡萄糖苷酶抑制效果较好，但是与前几种功能因子相比，其对胆固醇胶束溶解度、α-淀粉酶、胰脂肪酶酶，胆固醇酯酶的效果比较弱。所以根据以上研究结果，EGCG、绞股蓝皂甙、槲皮素、牡丹籽油和苦瓜提取物对胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶和胆固醇胶束溶解度抑制效果较好。因为茶多酚和银杏黄酮分别含EGCG和槲皮素比较多，所以最后确定茶多酚、银杏黄酮、绞股蓝皂甙、牡丹籽油和苦瓜提取物作为复方的功能性成分。

2.2 功能因子对消化酶和胆固醇胶束溶解度的抑制率

图2比较了5种功能因子对胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶、胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度的IC50值。由图2可以看出，与其他4种成分相比，茶多酚对胰脂肪酶，α-淀粉酶和胆固醇胶束溶解度的抑制效果明显强于其他4种成分，其IC50值分别是0.45、0.42和0.15 mg/mL低于其他4种成分，且茶多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果强于荷叶黄酮 （2.20 mg/mL，1.86 mg/mL）[18]；茶多酚对胰脂肪酶活性的抑制效果优于刺五加皂甙（0.75 mg/mL）[19]。但是茶多酚对胆固醇酯酶的抑制效果最弱。苦瓜提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果最好，其IC50值为0.41 mg/ml，圆叶葡萄甲醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制IC50值为1.50 mg/mL[20]。银杏黄酮对胆固醇酯酶的抑制效果最好，其IC50值为0.26 mg/mL低于已报道的苦瓜水提物对胆固醇酯酶的抑制效果[21]。

图 2 5种功能因子对胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶和胆固醇胶束溶解度的IC50Fig.2 IC50value of pancreatic lipase，α -amylase，α -glucosidase，cholesterol eaterase and cholesterol micelle solubility by 5 functional factors

2.3 正交t值法-主药分析

结果显示，茶多酚、牡丹籽油和银杏黄酮对α-淀粉酶和胆固醇酯酶活性加权综合抑制效果作用显著，因此茶多酚、牡丹籽油和银杏黄酮是复方主药成分。绞股蓝皂甙和苦瓜提取物可能为辅药。

2.4 正交t值辅药交互作用分析

用正交表着重分析辅药彼此间的交互作用，A（茶多酚、牡丹籽油和银杏黄酮）、B（绞股蓝皂甙）、C（苦瓜提取物）质量浓度为0.5 mg/mL，按照图2 IC50的比例设置浓度配比。

由表8可以看出，绞股蓝皂甙和苦瓜提取物与复方主要成分可以协同性抑制胆固醇酯酶和α-淀粉酶活性。

2.5 D值优化法复方功能性成分配比

各因素确定后，筛选出来的功能因子每种为一个因素，随机选定为A、B、C、D、E等。每个因素设3个水平，从胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度5个评价指标中任意选取3个。以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胆固醇酯酶的IC50值为水平剂量依据，在此基础上适当增减（如表5）。总质量浓度是0.5 mg/mL，根据α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胆固醇酯酶活性抑制率，用D值优化法进行剂量优化分析。

表2 主药分析的实验结果Table 2 Result of primary medicine analysis

表3 因素及水平Table 3 Factors and level

表4 正交t值法分析辅药交互作用（n=3）Table 4 Analysis of adjuvant interaction by orthogonal t value design

表5 因素及水平Table 5 Factors and level

图3 D值法优化实验数据处理结果Fig.3 Analysis table of dose optimization by D value optimization

由复方对3种酶的抑制效果可以看出，A3质量浓度（苦瓜提取物）时，复方对胆固醇酯酶，α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于A1和A2质量浓度；B1、B2和B3（银杏黄酮）3种质量浓度的比较可以看出，B3浓度时，复方对α-淀粉酶和胆固醇酯酶的抑制效果优于B1和B2；C2（茶多酚）时，复方对胆固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于C1和C3；D1（绞股蓝皂甙）时，复方对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胆固醇酯酶的抑制效果优于D2和D3，E2（牡丹籽油）时，复方对胆固醇酯酶和α-淀粉酶的抑制效果优于E1和E1。因此，根据复方5种功能因子3个水平对3种消化酶活性的抑制效果可以看出A3、B3、C2、D1和E2是复方的最佳质量浓度， 最佳剂量配比为A3∶B3∶C2∶D1∶E2=m（苦瓜提取物）∶m（银杏黄酮）∶m（茶多酚）∶m（绞股蓝皂甙）∶m（牡丹籽油）=8∶8∶6∶5∶8。 复方对 α-淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶和胆固醇酯酶的IC50值分别为0.40、0.38 和 0.32 mg/mL。

3 结 语

首先比较了9种功能因子对胆固醇酯酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶和胆固醇胶束溶解度抑制效果，最后确定茶多酚、银杏黄酮、牡丹籽油、苦瓜提取物及绞股蓝皂甙作为复方的功能成分，并且计算出IC50值。以功能因子对α-淀粉酶和胆固醇酯酶活性抑制效果IC50为依据，对茶多酚、银杏黄酮、牡丹籽油、苦瓜提取物及绞股蓝皂甙5种成分进行主药分析及辅药交互作用分析。正交t值法源于正交设计，适合多味药的复方研究，可以用较少的试验次数分析较多的因素，找出各因素的主次地位及交互作用。D-优化实验设计在总量不变的基础上用较少的实验设计实现多目标同步优化。作者结合了正交t值和D-优化实验的优点，正交t值法进行了主药分析和辅药交互作用分析，用D-优化实验实现α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胆固醇酯酶多目标同步优化，确定了最优剂量配比（IC50值分别是 0.40、0.38、0.32 mg/mL），其对消化酶活性的抑制效果强于已报到的植物提取物荷叶黄酮、刺五加皂甙、圆叶葡萄甲醇提取物及苦瓜水提物[18-20]。

目前已有大量文献报道了功能因子对胰脂肪酶、α-淀粉酶[22]、α-葡萄糖苷酶[23]、胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度抑制效果[24]。茶多酚对胆固醇胶束溶解度、胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胆固醇酯酶抑制效果的研究已有报道[25]。目前还没有研究发现银杏黄酮对胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度的作用效果，但是Liu研究了荷叶黄酮对胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制效果[18]，其IC50值分别是0.38、2.20和1.38 mg/mL，本研究中银杏黄酮对其的IC50值分别是1.21、0.76和0.51 mg/mL。虽然荷叶黄酮对胰脂肪酶的抑制效果优于银杏黄酮，但是银杏黄酮对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于荷叶黄酮。Hassan和Cheng研究了银杏提取物（银杏黄酮24%）体内降血糖效果，与未经处理的糖尿病小鼠相比，银杏提取物显著性降低了糖尿病小鼠的血糖水平 （p＜0.05）。磷酸化黄酮对胆固醇酯酶的抑制效果已被研究，其IC50值从纳摩尔级到微摩尔级，但是也有一些没有表现出抑制效果[26]。这些合成的抑制子不同的抑制活性归因于构效关系。然而实验中银杏黄酮或者配方对胆固醇酯酶活性抑制的IC50值分别是 0.26和 0.32 mg/mL（图 2），虽然合成的纳摩尔级的抑制子有更好的抑制效果，但是在食品工业中使用天然产物代替合成抑制子是一种发展趋势。Liu研究了人参皂甙[27]对胰脂肪酶的抑制效果，人参皂甙0.5 mg/mL对胰脂肪酶的抑制率为10.1%，且动物实验也表明了体外酶抑制实验和体内动物降血脂实验的相关性，配方中的茶多酚对胰脂肪酶抑制率IC50值为0.45 mg/mL，绞股蓝皂甙对胰脂肪酶抑制率IC50值为0.58 mg/mL，茶多酚和绞股蓝皂甙对胰脂肪酶的抑制效果优于人参皂甙。Lee研究了桔梗皂甙对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，桔梗皂甙1 mg/mL对α-葡萄糖苷酶活性抑制率为35%，本研究的配方对α-葡萄糖苷酶的IC50值为0.38 mg/mL，配方的抑制效果优于桔梗皂甙[28]。Santoscoy研究了黑豆皂甙和黄酮对胆固醇胶束溶解度的抑制效果，黑豆皂甙5 mg/mL时对胆固醇胶束抑制率为55.4%[29]，本研究配方的5种成分对胆固醇胶束溶解度抑制率IC50＜3.0 mg/mL。Su研究报道了油酸、亚油酸和α-亚麻酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，研究发现油酸、亚油酸和α-亚麻酸对α-葡萄糖苷酶活性抑制率IC50值分别是0.022、0.033 和 0.044 mg/mL[30]，对 α-淀粉酶活性抑制率均大于1 mg/mL，在本实验中牡丹籽油对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率分别是1.21和0.61 mg/mL，配方对其的抑制率分别是0.40和0.38 mg/mL，由此可见配方中的牡丹籽油可以和其他四种成分协同性抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性。从以上报道可以看出，配方5种成分可以有效地降低胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胆固醇酯酶活性和胆固醇胶束溶解度，并且目前没有研究这5种成分的协同效应的报道，作者通过正交t值或D优化法优化组合了5种功能因子的剂量，结果表明功能因子复方体外有效地降低小肠消化酶及胆固醇胶束溶解度，且抑制效果优于单一成分。