棉酚对Ⅰ型过敏小鼠Eotaxin及CCR3表达水平的影响

顾庆新，王铁林，过雨晴，蒋萌萌，马 丽，曲思，宋博翠

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319）

过敏反应是指机体在对某些抗原产生初次应答后，再次接受相同抗原刺激时，机体产生一种以生理功能紊乱或组织细胞损伤为主要特征的特异性免疫应答，临床上主要表现为过敏性鼻炎、皮肤搔痒、荨麻疹、支气管哮喘等症状。由于其发病率较高，因此成为影响人类健康的重要疾病之一。

在四种不同类型的过敏反应中最常见的为I型和IV型。其中，I型过敏反应是免疫系统中最强烈的病理反应之一，主要特征为机体针对抗原产生IgE抗体，Eos组织出现浸润现象，释放炎性介质。通过研究发现，Eos在组织中出现浸润主要是通过趋化因子与其表面高表达的受体CCR3的结合实现的，能与受体CCR3结合的趋化因子种类较多，但嗜酸粒细胞趋化因子（Eotaxin）是唯一能够高选择性与其特异性结合的配体，因此降低Eotaxin的表达是控制过敏性疾病进程中的重要环节。

目前对治疗过敏性疾病，采用药物治疗是一种有效的控制手段。但现有的治疗药物中存在开发成本高、副作用大等问题，而中药因其价格较低、副作用小等优点，越来越受到国内外学者的关注。棉酚（Gossypol，GOS）是一种天然黄色多酚羟基双萘醛类化合物，主要存在于锦葵科植物棉花的根、茎和种子中，近年来发现GOS具有抗炎、抗病毒、抗疟、抗氧化及抗肿瘤等药理作用，但其抗过敏的药理作用还未见报道]。前期研究我们发现，棉酚具有潜在的抗过敏作用，本研究通过检测GOS对Ⅰ型过敏反应小鼠血清中,Eotaxin及其特异性受体CCR3水平的影响，初步探讨GOS对I型过敏反应的抑制作用，将其作为潜在的抗过敏药物进行研究与开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物

健康Balb/c小鼠，雌雄各半8～10周龄，体重为18～20 g，均购于吉林大学实验动物中心，小鼠适应1周后进行试验。

1.1.2 实验试剂

RPMI-1640培养液（美国Hyclone公司）；棉酚（中国药品生物制品检定所）；环磷酰胺（美国Sigma公司）；mRNA反转录试剂盒（美国Axygen公司）；琼脂糖（Biowest公司）；OVA(美国Sigma公司)；Al(OH)3凝胶（河南乐水环保科技有限公司）；Eotaxin试剂盒（美国Biolegend公司）；Trizol试剂（赛默飞世尔科技）；胎牛血清（美国Gibco公司）；PBS缓冲液（江苏绿叶生物科技公司）；其它化学试剂均为分析纯，购于吉林化学试剂厂。

1.2 方 法

1.2.1 Ⅰ型过敏反应小鼠模型的建立

实验动物选取BALB/c小鼠，体重为18～20g，共60只。随机分为6组，每组10只。分别为对照组、模型组、地塞米松组、棉酚低、中、高剂量组。取0.1mL含lmg/mL-1的OVA的免疫原液和0.05mg mL-1的Al(OH)3，对模型组和棉酚低、中、高剂量组小鼠进行免疫。初次免疫方式是对每只小鼠背部两侧分多点进行皮下注射，初次免疫后第3周，取0.1mL相同的免疫原对模型组和药物组小鼠后腿肌肉部位进行注射来加强免疫，对照组小鼠以同样方法用生理盐水进行免疫。除对照组外，在建模第1天开始小鼠腹腔注射给药0.1mL。

1.2.2 血样采集

小鼠加强免疫后7d，末次给药1h后，通过摘取小鼠眼球方式进行采血，血样分别放入一个无菌离心管和一个含肝素的离心管中。其中，无菌离心管血样于4℃冰箱中静置过夜。第2天，将血样放置离心机中，转速1000×g，离心20 min，使用移液器将分离后的血清移至新的离心管中待用。含肝素的离心管血样使用淋巴细胞分离液分离出外周血单一核细胞（PBMC）后，将样品放入Trizol试剂里，-80℃冰箱中保存待用。

1.2.3 ELISA法检测血清中IgE、Eotaxin和CCR3的含量

将血清用样品稀释液稀释20倍后，采用双抗体夹心ELISA法检测炎性介质IgE、Eotaxin和CCR3浓度。具体做法是将一抗包被于酶标板4℃过夜后，第2d加入标准品和待测样品37℃孵育2h让其充分与一抗结合，加入生物素化的抗体形成免疫复合物，加入辣根过氧化物酶使其出现黄色，加终止液，待颜色变深，使用酶标仪在450nm处测OD值，通过绘制标准曲线求出标本中待测蛋白的浓度。

1.2.4 RT-PCR法检测外周血中Eotaxin和CCR3 mRNA表达

细胞总RNA提取采用Trizol试剂并严格按照试剂说明书进行。根据Genbank中嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin、CCR3的核苷酸序列进行引物设计，引物的序列见表1，由上海生物工程有限公司合成，实验样品在1%的琼脂糖凝胶中电泳后进行凝胶成像分析。

1.3 统计学方法

数据采用 SPSS 13.0软件进行统计学分析，以均数±标准差（X±S）来表示，各组间比较采用方差分析进行统计，p＜0.05具有统计学意义，p＜0.01具有显著统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 ELISA法检测血清中IgE的含量

表1 PCR引物序列

通过ELISA试剂检测血清中IgE含量的影响，结果如图1所示，与空白对照组相比，OVA组血清中IgE含量较空白对照组高，说明小鼠模型建立成功。使用棉酚作用后，Ⅰ型过敏小鼠血清中IgE的含量明显下降，中、高剂量棉酚药物组作用效果极其显著（p＜0.01）。

2.2 ELISA法检测血清中Eotaxin的含量

棉酚对血清中Eotaxin含量的影响结果如图2所示。与空白对照组相比较，模型组小鼠血清中Eotaxin的浓度显著提高。当使用棉酚作用后，血清中Eotaxin的浓度均有所下降，其中，中、高剂量组作用极为显著（p＜0.01），并且抑制Eotaxin的浓度与棉酚的浓度呈剂量依赖关系。

图1 ELISA法检测血清中IgE含量

图2 ELISA法检测血清中Eotaxin的含量

2.3 RT-PCR法检测外周血中Eotaxin mRNA表达

通过RT-PCR检测棉酚对外周血中Eotaxin mRNA表达的影响，结果如图3所示。与空白对照组相比，模型组Eotaxin mRNA表达水平显著升高。当使用棉酚作用后，与模型组相比较，Eotaxin mRNA的表达水平均显著下降（p＜0.01），其中，棉酚中、高剂量组的效果比环磷酰胺还好。

2.4 RT-PCR法检测外周血中CCR3 mRNA表达

图3 RT-PCR法检测外周血中Eotaxin mRNA表达

图4 RT-PCR法检测外周血中CCR3 mRNA表达

棉酚对外周血中CCR3 mRNA表达的影响如图4所示。与空白对照组比，OVA组CCR3 mRNA表达显著提高。与OVA模型组相比，当使用棉酚作用后，棉酚低剂量组的CCR3 mRNA的表达显著下降（p＜0.05），而高、中剂量组作用极其显著（p＜0.01）。

3 小结

本实验通过对I型过敏小鼠背部两侧皮下多点注射的方式建立模型。其研究结果可以看出，空白对照组相比较，模型组血清中的的Eotaxin浓度、外周血中Eotaxin和CCR3 mRNA表达水平显著升高。当使用棉酚治疗后发现，棉酚能够降低通过降低Eotaxin和CCR3 mRNA的表达，其高剂量组作用最为显著，其效果呈现剂量依赖关系。说明棉酚能够通过抑制Eotaxin和CCR3 mRNA的表达，减轻EOS的分化、活化、募集及局部浸润，从而控制症状，减轻过敏反应发展，达到治疗过敏性疾病的目的。