大鳞副泥鳅肾脏的胚后发育组织学观察

刘亚秋,王志坚,李新辉,常藕琴

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，广州 510380； 2.西南大学生命科学学院，淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室， 水产科学重庆市重点实验室，重庆 400715)

鱼类的肾脏发育经过前肾和中肾两个阶段[1]，前肾的结构比较简单，而中肾的结构趋于复杂[2]；对于鱼类肾脏发育的研究，国外从 20 世纪 50年代开始已有少量文献报道。国内的相关研究很少，仅发现研究者对鲇(Silurusasotus)[3]、南方鲇(Silurusmeridionalis)[4]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[5]以及贝氏高原鳅(Trilophysableekeri)[6]前肾和中肾的发生进行了较详细的描述。大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)，属于鲤形目花鳅科副泥鳅属，是一种底栖生活的小型经济鱼类[7]。目前主要分布于中国的长江中下游、珠江流域以及东南亚等地区[8]。在低氧环境下，大鳞副泥鳅存在肠道辅助呼吸的习性[9]。对大鳞副泥鳅的系统性研究发现，其仔稚鱼发育及各器官系统的形态结构发生上都表现出一定特殊性[10-12]。本研究通过对大鳞副泥鳅体肾胚后发育过程的观察，探讨鱼类肾这一重要器官发生、发育的一般规律，为鱼类发育生物学积累组织形态学基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

大鳞副泥鳅受精卵由本实验室提供，同一批受精卵于2015年4月22日孵化出膜，饲养50 d，于6月12日结束，饲养于容积60 L的3个循环水族缸内，饲养期间循环水族缸水温21～23 ℃，光照周期12L∶12D，微流水饲养。水质参数：溶氧为(7.13±0.61)mg/L，氨氮小于0.02 mg/L，pH 7.6～8.1。4日龄仔鱼开始投喂丰年虫(天津市丹阳水产科技有限公司)，10日龄开始投喂混合饵食(丰年虫和微颗粒S1饲料)，20日龄开始完全投喂微颗粒S3号饲料，饲料均购自于山东升索渔业饲料研究中心，投喂之前清除污物。

1.2 方法

仔鱼出膜后24 h作为1日龄仔鱼。从初孵仔鱼(仔鱼刚出膜)开始取材，10日龄前(含10日龄)每天早上8∶00投喂前取材1次，10日龄后每2～5 d取样1次，每次取10～12尾并测量其全长，取材截止于仔鱼出膜50 d。每次取10～12个组织样品Bouin’s液固定。材料均以石蜡包埋，切片厚度5 μm，分别以横向和纵向两种方式进行切片，之后进行苏木精-伊红(haematoxylin-eosin,H.E)染色，中性树胶封片。

1.3 数据分析

每项指标采用IPP图像分析软件随机选取 30 个样本测量相关数据。制片后采用 NIKON ECLIPSE 80i显微摄像系统观察、照相。每日龄仔稚鱼肾脏组织，任意取3张切片随机选10个视野，每项指标采用 IPP
图像分析软件测量相关数据。所有统计值均用平均值±标准差(Mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 生长特点

大鳞副泥鳅仔鱼、稚鱼呈线性生长，拟合方程分别为：y=1.047x+0.356(R2=0.99)(图1)。

图1 大鳞副泥鳅仔稚鱼全长变化

2.2 前肾发育特征

显微观察发现2日龄仔鱼肾脏由一条直达躯干后部的原始肾管构成，其管壁细胞排列疏松，背侧有大血管(图版I-1)。4日龄，前肾小管径较小(长径：(39.1±7.1) μm；短径：(28.3±3.1) μm)，管壁为立方上皮，细胞核位于细胞中心，核呈椭圆形，胞质呈淡粉红色，弱嗜酸性，细胞高度为(7.5±1.1)μm，腹膜开始出现黑色素细胞(图版I-2)。5日龄，前肾小管上皮为单层立方上皮，细胞高度为(10.4±1.9) μm，细胞间界限不清(图版I-3)。7日龄，肾间质大幅增多，可见红细胞大量分裂，肾间质与前肾小管间存在空白区(图版I-5)。12日龄，前肾小管继续分化，凹形的管状结构，管腔增大(图版I-6)。20日龄前肾小管继续分化，其管腔增大，管腔上皮细胞排列较紧密，细胞高度为(11.09±3.1) μm。

2.3 中肾发育特征

4日龄，中肾导管壁组织横切面观察，一般由 6～7 个立方状细胞围成，周围可见扁平或圆形的嗜碱性细胞(图版II-1)。5日龄，中肾导管细胞质嗜酸性略有增强与血管相邻，外围见造血干细胞团及原红细胞(图版II-2)。7日龄，紧邻中肾导管壁及肾间质中可见细胞质嗜碱性的未分化细胞团以及造血干细胞(图版II-3)。12日龄，中肾肾小管分布密度为(497.2±34.1)个/mm2，其中可见一种肾小管呈椭圆形或长条形(长径：(32.2±2.1) μm；短径：(13.2±1.7) μm)，管腔小，腔上皮联系疏松，胞核大而圆，细胞质弱嗜碱性，细胞高度为(9.76±2.1) μm)(图II-4)。15日龄中肾结构较松散，腹膜分化完全，将体肾与腹腔分开，出现肾单位，肾小球(长径：(87.6±8.7) μm；短径：(80.2±7.3) μm)形成由间充质细胞构成网眼状结构，网眼内可见红细胞，肾脏腹侧可见大血管(图II-5)。20日龄，中肾腹侧血管(静脉)充满血液，近曲小管(长径：(29.3±3.5) μm；短径：(23.1±2.7 μm)和远曲小管(长径：(34.1±3.8) μm；短径：(28.2±2.6) μm)分化形成，数量大幅增多，肾小管密度为(516.4±63.2)个/mm2(图II，6)。30日龄中肾近曲小管和远曲小管数量增多，肾小管密度为(607.4±48.1)个/mm2，中肾小管管壁多为单层柱状上皮细胞组成，细胞高度为(11.49±3.2) μm)，排列十分紧密，界限不清，管腔面有明显刷状缘。细胞核大且着色深，呈圆形或者椭圆形，多位于细胞中位(图II-7)。50日龄肾脏结构致密，中肾拟淋巴组织发育也趋于成熟，肾小管密度为(709.3±89.4)个/mm2，肾小管上皮细胞高度可达(12.39±2.8) μm)，近曲小管(长径：(26.3±3.6) μm；短径：(20.1±2.8) μm)、远曲小管(长径：(32.1±3.8) μm；短径：(25.2±2.7) μm)，以及集合管(长径：(47.1±6.8) μm；短径：(23.3±3.8) μm)等肾小管结构趋于完善(图II-8,9)。

3 讨论

肾脏作为硬骨鱼类的重要器官之一，有着排出代谢废物、调节机体水盐代谢和酸碱平衡、分泌生物活性物质功能。与多数硬骨鱼类类似，大鳞副泥鳅肾脏的发育大体上分两个阶段：前肾期和中肾期。鱼类胚胎期的泌尿器官为前肾亦称原肾[5]。大鳞副泥鳅在2日龄即可观察到前肾由一对直的沿着脊椎直抵躯干后部的原肾小管组成。它是由紧接在前肾后面的一系列生肾节发育而成的管状体，位于体腔背壁，腹面覆盖着间皮。马克勤等[2]研究表明仔鱼在发育初期其代谢废物主要经前肾管排出体外，而前肾周围未见血管球，故滤尿效能低。发育至4日龄可见造血干细胞，之后造血干细胞分化为各种血细胞，血细胞分布在体肾间质成为拟淋巴组织。这与南方鲇[4]、大黄鱼(Larimichthyscrocea)[13]及鲤(Cyprinuscarpio)[14]等类似。相较于贝氏高原鳅[6]，大鳞副泥鳅中肾发育较快。这可能由于贝氏高原鳅生存温度要高，低温环境下，动物的新陈代谢缓慢，各器官的发育速度自然就慢。在发育早期，大鳞副泥鳅肾脏不管是前肾还是中肾，都存在这类肾小管：肾小管管壁内有刷状缘，壁细胞由弱嗜酸性立方上皮及细胞核扁平端位的强嗜酸性细胞两类间隔分布，为单层柱状上皮。部分此类肾小管管壁转变为有内层细胞核圆而深染细胞界限不清的细胞和外层核圆而淡染、细胞质弱嗜碱性的立方上皮的假复层上皮结构，这类肾小管在成鱼体肾中亦可见到[15-17]。

大鳞副泥鳅长期生活在静水的底层，常出没于池塘、沟渠以及水田底部等低氧的环境下，而不同于其他鳅科鱼类喜于生活在含氧丰富的流水的环境中[10]。从组织切片来看，大鳞副泥鳅的肾小体较小，但其肾小管数目较多，肾小管分布有显著刷状缘。有研究表明在缺水环境中，肾小管重吸收水分的能力会变强[18]。发达的刷状缘，表明其对滤出的蛋白质、氨基酸、葡萄糖以及其他大分子物质的重吸收作用较强。林浩然[19]认为其可能参与等渗的Na+的主动重吸收，在维持渗透压及水盐平衡中发挥重要作用。Endo等[20]研究表明，Na+从管腔到上皮细胞的主动运输可能由于是淡水鱼类对从高渗型尿液中吸收Na+的适应。从近曲小管到收集管，刷状缘的发达程度逐渐减弱，可知近曲小管可能是原尿中的有机大分子营养物质的重要的吸收场所[21]。大鳞副泥鳅肾在发育过程中，肾脏各部分对糖类等有机分子和离子重吸收的组织结构特点，是维持其体内高渗透压的组织基础，使得大鳞副泥鳅可以离开水，耐低氧，其肾脏的结构和功能发育是与生态环境长期适应的结果。

图版I 大鳞副泥鳅前肾发育组织学观察 Plate I Histological observation on head- kidney development of P.dabryanus 1.2日龄仔鱼(纵切)；2.4日龄仔鱼(纵切)； 3.3日龄仔鱼(纵切)； 4.7日龄稚鱼(纵切)； 5.12日龄稚鱼(横切)； 6.20日龄稚鱼(横切)； H.E染色。ES食道；IN肠道；Me黑色素细胞；PD前肾小管； RBC红细胞； RT肾小管；V静脉

图版II 大鳞副泥鳅中肾发育组织学观察 Plate II Histological observation on mid- kidney development of P.dabryanus 1.4日龄仔鱼(横切)；2.5日龄仔鱼(横切)； 3.7日龄稚鱼(纵切)； 4.12日龄稚鱼(纵切)；5.15日龄稚鱼(纵切)； 6.20日龄稚鱼(横切)； 7.30日龄稚鱼(横切)；8.50日龄稚鱼(横切)；9.50日龄稚鱼(横切)，H.E染色。CT集合管；DS远曲小管； IN 肠道；LT 拟淋巴细胞； Me 黑色素细胞；MD：中肾导管 Pe腹膜；PS 近曲小管；RBC 红细胞；RC 肾小体；RT 肾小管；S 血窦； SC分泌细胞；UC未分化细胞；V 静脉