响应面法优化氨基酸组成对小鼠急性肾衰的保护作用

李雪松， 谢方圆， 农秋莲， 张劲松， 王 群， 吴 昊， 阮祥春*

(1.安徽省动物卫生监督所，安徽 合肥 230001； 2.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036；3.安徽省兽药饲料监察所，安徽 合肥 230091)

肾脏对蛋白质代谢起着多方面作用，包括低分子量蛋白质降解和氨基酸合成。肾功能衰竭患者随着时间的推移会继续失去肾功能，最终进展至终末期肾病。急性肾功能衰竭(ARF)是临床常见的并发症，并且能引起较高的死亡率[1]。ARF产生可由严重的创伤、休克、败血症等引起，同时与临床治疗方式也有密切的关系。另外过量接触有毒性的重金属(例如铅、汞或铬等)也能引起急性肾衰。临床上常测定血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Cr)作为判断肾衰的主要指标。氯化汞诱导的肾脏毒性是一种复杂的现象，其特征是血清Cr和BUN浓度升高，严重的近端肾小管坏死，继而恶化和肾功能衰竭[2]。

正常成人或肾功能衰竭患者口服某些氨基酸增加肾小球滤过率[3]，可缓解肾衰对机体造成的危害。此外，少量必需氨基酸导致氮平衡增加，尿素氮的血清水平降低[4]。 Naylor发现对急性肾衰的病人使用必需氨基酸，病人的存活率高于未使用氨基酸24%的存活率[5]，得出了必需氨基酸是急性肾衰患者营养需要中重要组分的结论。这些发现指出了氨基酸对ARF的重要性，特别是对于正常蛋白质合成和避免氨基酸不平衡[6-7]。

本研究目的是利用氯化汞诱导的ARF，使用响应面法(RSM)优化氨基酸溶液组方。响应面法(RSM)是一种有价值的数学理论和统计技术，可以通过复杂的相互作用建立可变参数优化模型。应用RSM分析自变量对效应的影响，优化当前Box-Behnken中的两个BUN和Cr单独参数，通过氯化汞诱导性肾衰竭模型以获得对小鼠急性肾衰竭具保护作用氨基酸溶液的最佳组方。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验动物 18～22 g昆明种小鼠，雌雄各半，购于安徽医科大学动物实验中心。

1.1.2 试验试剂 氯化汞(上海国药集团试剂有限公司)；亮氨酸(Leu)、苏氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)和谷氨酰胺(Gln)均购于合肥欣得生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 氨基酸溶液的制备 通过部分因子试验从12个氨基酸[2, 6-7]中选择Leu、Thr、Met、Ile、Val、Arg、His和Gln 8个氨基酸。然后，依据部分因子试验结果，选择Leu、Thr和Met通过RSM的优化。其中A为Leu(低水平：10.00 g，高水平：20.00 g)，B为Thr(低水平：1.00 g，高水平：9.00 g)和C为Met(低水平：1.00 g， 高水平：10.00 g)。对三因素2水平利用Design Expert 8.06软件中的Box-Behnken设计15个氨基酸组方的试验组，在中心点设置有3个重复(表1)。氨基酸溶液组成中除了含有Leu、Thr和Met外，同时还含有部分因子试验得出的Ile、Val、Arg、His和Gln组分，均以相同比例与Leu、Thr和Met混合。按照15个组方的氨基酸比例，称取一定质量的氨基酸，加入适量水，用高速组织匀浆机20 000 rpm进行处理，制备不同组方的氨基酸溶液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 试验动物的分组及给药 将体重为18～22 g的昆明种小鼠136只，雌雄各半，分成17个组，每组8只。小鼠在室温为25±2 ℃环境下适应性饲养3 d，喂饲清洁饲料，自由饮水。试验分为阴性对照组，阳性对照组，氨基酸1～15组。除对照组外，根据预试验剂量，配制1 mg/mL 氯化汞按照5 mg/kg对小鼠进行腹腔注射；阴性对照组腹腔注射等体积的生理盐水。在注射之前，老鼠需要禁食12 h。在氯化汞腹腔注射24 h后，氨基酸组口服0.2 mL的按照1～15组制备的氨基酸溶液，阴性、阳性对照组口服同等体积的生理盐水。

1.2.3 样品采集 口服氨基酸试验持续5 d，在最后一次口服氨基酸12 h后，将小鼠用乙醚麻醉，断头取血。将采集的血液，3 500 rpm离心10 min，吸取血清，冷冻保存，待测。

1.3 测定项目及分析方法

血清样品的BUN和Cr由安徽农业大学动物医院进行检测。数据统计分析使用SPSS 18.0软件。数据参数的分析采用单因素方差分析，然后利用最小显著性差异法比较结果，P<0.05被认为是统计上的显著差异。

2 结果与分析

2.1 Box-Behnken设计与血清中BUN和Cr结果

阴性对照组的小鼠血清中的BUN和Cr分别为5.57±0.51 μmol/L和37.38±4.47 mmol/L；阳性对照组的小鼠血清中的BUN和Cr分别为58.61±4.45 μmol/L和60.25±2.75 mmol/L。按照3因素Box-Behnken设计的15个氨基酸组方，分析对氯化汞诱导的急性肾衰模型中的BUN和Cr有不同程度的影响。具体氨基酸组方及相应的血清生化结果(表1)。

表1 Box-Behnken 设计和相应响应值

*注：运行的顺序在试验期间是随机的，以降低误差。

*Note：The order of the runs was randomized during experiment to minimize selection error.

2.2 响应面模型的分析

依据Box-Behnken设计中的血清BUN和Cr结果，对响应面的模型进行分析。在模型的方差分析中，3种氨基酸对BUN的P<0.01,对Cr的P<0.05,说明3种氨基酸的响应面筛选的方法是有效的。在BUN和Cr模型中的失拟项的参数F的值分别为0.22和0.41，均不显著(P>0.05)，说明该试验获得的数据是有效的，数据差异在有效范围内。试验结果表明亮氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸对小鼠血清中的BUN和Cr均有一定的影响。其中因素B、C、AC、A2、B2和C2对小鼠血清中的BUN产生极显著的影响(P<0.01)(表2)。因素A2和C2对小鼠血清中的Cr有着极显著的影响(P<0.01)，而因素AC、BC和B2对小鼠血清中的Cr有着显著的影响(P<0.05)(表3)。

表2 响应面二次模型的方差分析 (BUN)

表3 响应面二次模型的方差分析(Cr)

2.3 氨基酸组方优化

RSM成功地优化了与血清BUN和Cr水平相关的氨基酸组成。为了提供更好的可视化，三维图和等高线图显示了ARF小鼠血清BUN和Cr水平与Leu、Thr和Met的相互关系(图1)。响应面优化的最佳氨基酸组合物是：Leu 19.94 g、Thr 1.03 g和Met 6.53 g。 在此条件下，预测急性肾功能衰竭血清的BUN和Cr分别为5.93 μmol/L和34.00 mmol/L(表4)。

图1 不同因素变量对响应变量(3D响应面)相互作用的影响

图2 不同因素变量对响应变量(等高线图)相互作用影响

效应Response预测Prediction标准差Std Dev标准误SE95%置信区间95% Confidence95%低区间95%高区间BUN5.928 335.213 326.884 71-11.769 423.626Cr34.0019.386 5212.395 82.136 5265.865 5

3 结论与讨论

最近，RSM被普遍应用与各种领域，如纳米技术，化学和医学[8-12]。 RSM可用于通过复杂的相互作用建立优化模型[13-15]。事实上，血清中Cr和BUN的浓度主要是评估临床中肾脏疾病的指标。RSM阐明了不同的氨基酸及其相互作用对血清中BUN和Cr浓度的影响，利用RSM优化了氨基酸组成对氯化汞诱导急性肾衰模型小鼠具有一定的作用。许多实验模型表明，氨基酸可改善进行性肾损害[16]。在本研究中，氨基酸溶液给小鼠口服后降低氯化汞模型中小鼠的血清Cr和BUN水平。 氨基酸对Cr和BUN浓度的作用可归因于改善肾小球的滤过率。ARF引起的死亡率可以高达50%，在这项研究中，氨基酸组的小鼠未见死亡，而阳性对照组死亡率则为25%。口服氨基酸溶液能降低小鼠对氯化汞引起的急性肾衰的死亡率。在5 mg/kg的剂量下腹腔注射氯化汞，小鼠血清中的BUN和Cr分别为58.61±4.45 μmol/L和60.25±2.75 mmol/L。与对照组的的BUN和Cr分别为5.57±0.51 μmol/L和37.38±4.47 mmol/L相比，可以成功对小鼠进行急性肾衰的病理造模。亮氨酸,苏氨酸,甲硫氨酸均对血清的肌酐和尿素氮具有不同程度的影响，利用响应面法获得的最佳组方为亮氨酸19.94 g，苏氨酸1.03 g，甲硫氨酸6.53 g。

本试验通过氯化汞对小鼠诱导急性肾衰模型，以小鼠血清中的BUN和Cr为主要考察指标，通过响应面法优化氨基酸的最佳组方。从目前的血清生化指标来看，氨基酸组合物能降低氯化汞诱导急性肾衰小鼠的血清中的BUN和Cr，至于优化后的氨基酸组方对氯化汞诱导的急性肾衰保护作用的大小，需要通过组织病理学来进行进一步的研究。