白芷茎总香豆素的纤维素酶提取工艺研究

薛天乐， 王 庆， 程 翔

(亳州职业技术学院 药学院，安徽 亳州 236800)

白芷为伞形科植物白芷的干燥根，其用途广泛，需求量较大。现代科学研究表明，白芷主要含有香豆素类的活性物质，具有镇痛消炎、抗氧化等作用，临床上主要用于外科炎症、皮肤科和妇科等疾病的治疗[1]。白芷除药用外，还被用来制作保健品、香料和化妆品等，虽然白芷在全国的种植面积不小，但是仍不能满足市场需求，每年的缺口很大[2]。白芷中的主要有效成分为香豆素类的化合物，通过预试验发现，白芷采收时被丢弃的部分也含有香豆素类成分，且白芷地上部分的体积较大，具有重大开发利用价值。然而，植物中的有效成分大部分处于细胞内，被较厚的细胞壁包裹，溶出度较低，白芷茎和叶相比，此类问题更加突出。纤维素酶可水解植物细胞壁的纤维结构，提高有效成分的提取率，在天然药物的提取方面应用广泛[3]。本试验以白芷茎总香豆素的提取率为指标，采用正交设计，借助纤维素酶研究白芷茎的最佳提取工艺，希望对白芷地上部分的综合开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

白芷茎采集自亳州市谯东镇；欧前胡素产自中国食品药品检定研究院，批号：110826-201616；纤维素酶，CAS号：9012-54-8，分子量：45 000～75 000，山东西亚化学工业有限公司，批号：L54738；其他试剂均为分析纯。紫外可见分光光度计(UV1901PC),上海奥析科学仪器有限公司；万分之一电子分析天平(MF1204)上海亚津电子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验用溶液的制备 取欧前胡素约5 mg，精密称定，用60%的乙醇定容于50 mL的容量瓶中，得标准品溶液。 分别称取白芷茎干燥粗粉4.0 g，加120 mL提取溶剂，按照试验设计，以不同的纤维素酶浓度、不同乙醇体积分数、不同提取温度来提取，提取终点灭酶10.0 min，使用上述条件同时提取2次，合并滤液并浓缩，用60%乙醇定容于50 mL容量瓶中，得供试品溶液。

1.2.2 测定波长的选择 在紫外区波段进行测定发现，标准品溶液和供试品溶液在300 nm处有共同的最大吸光度，有利于保证含量测定的准确性，且与文献报道一致，故选择300 nm为测定波长。

1.2.3 标准曲线的绘制 取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的标准品溶液，用60%的乙醇分别定容于10 mL的容量瓶中，于300 nm处测定吸光度(60%的乙醇溶液为空白溶液)，以吸光度为纵坐标(y)，标准品溶液浓度(μg/mL)为横坐标(x)，绘制标准曲线，得曲线方程为：y=0.044 6x-0.022 4，R2=0.997，表明欧前胡素在浓度范围4.6～20.3 μg/mL内具有良好的线性。

1.2.4 总香豆素的含量测定 准确吸取供试品溶液1.0 mL，用60%乙醇定容于50 mL容量瓶中，于300 nm处测定吸光度(60%的乙醇溶液为空白溶液)，利用线性求出总香豆素浓度，按下式计算总香豆素的提取率(R)。

上式中：C为利用线性求出总香豆素浓度(μg/mL)；N为稀释倍数(n=50)；V为提取的供试品溶液的定容体积(50 mL)；M为样品的质量(g)。

1.2.5 方法学验证 (1)稳定性考察 准确吸取供试品溶液1.0 mL，60%乙醇定容于50 mL容量瓶中，分别在0、2、4、8、12、24 h时测定其在300 nm处的吸光度(60%的乙醇为空白溶液)，结果RSD=1.6%，说明供试品溶液在24 h内稳定。 (2)精密度考察 吸取标准品溶液1.0 mL置于10 mL的容量瓶中，用60%乙醇定容后在300 nm处测定其吸光度(60%的乙醇为空白溶液)，重复测定5次，结果RSD=0.3%。 (3)重复性考察 在相同工艺条件下制备5份供试品溶液，分别测定其在300 nm处的吸光度(60%的乙醇为空白溶液)，结果RSD=2.1%，说明重复性良好。 (4)加样回收率考察 取已知含量的白芷茎的干燥粗粉5份，每份2 g，分别加标准品溶液5.0 mL，在相同工艺条件下制备5份供试品溶液，分别测算其总香豆素的提取率并计算加样回收率，平均加样回收率=100.43%，RSD=2.2%。

1.2.6 正交试验 预试验发现当料液比(g/mL)在1∶30及以上、提取时间在60 min及以上，提取率几乎不再增加，在预试验的基础上，以总香豆素提取率为判断指标，固定料液比(g/mL)为1∶30、提取时间为60 min，选取酶浓度(mg/mL)、乙醇体积分数、提取温度3个因素为考察对象，设计L9(34)型正交表，按照“2.1”节的方法进行正交试验(表1～2)。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

表1 正交试验结果

表2 方差分析

F0.05(2,2)=19.00; F0.01(2,2)=99.00。

综合分析表1～2可知，各因素对白芷茎总香豆素提取率的影响主次顺序为纤维素酶浓度>乙醇体积分数>提取温度，其中纤维素酶浓度对白芷茎总香豆素提取率具有显著影响。白芷茎总香豆素提取率最佳提取工艺条件为酶浓度2.0 mg/mL、乙醇体积分数45%、提取温度55 ℃。

2.2 验证试验

称取白芷茎的干燥粗粉3份，每份4.0 g，分别以最佳提取工艺进行提取，根据标准曲线及1.2.4节的方法进行测算，总香豆素提取率分别为1.55%、1.61%、1.59%，平均为1.58%。

2.3 不同提取法的比较

比较采用不同的提取方法白芷茎总香豆素的提取率，每种方法做3组平行试验，提取率取平均值(表3)。

表3 不同提取方法的总香豆素提取率

由表3可知，纤维素酶法的总香豆素提取率可达1.56%，比传统的加热回流法和煎煮法分别提高了27.9%和64.2%。

3 结论与讨论

本研究表明，白芷茎总香豆素提取率最佳提取工艺条件为酶浓度2.0 mg/mL、乙醇体积分数45%、提取温度55 ℃。应用最佳工艺进行白芷茎总香豆素的提取率可达1.58%，比文献报道的白芷根部的香豆素含量还要高[4-5]。同时，纤维素酶法具有提取条件温和，提取率高等优点[6-8]，和传统的加热回流法和煎煮法相比具有明显的优势，说明该法可以用于白芷茎总香豆素的提取。

结合课题组前期研究[9]，可以看出，同样以欧前胡素作为标准品，但是白芷叶和白芷茎的总香豆素紫外最大吸收峰是不一致的(白芷叶313 nm，白芷茎300 nm)，说明白芷叶和白芷茎中所含的香豆素类物质具有一定的差异性，研究时应注意区分。

近年来，资源相对不足已成为制约我国中医药发展的突出矛盾之一，对于药用植物资源，应实行综合评价与开发，以合理利用有效避免枯竭和浪费[10]。除白芷外，还有很多中药如白芍、紫苑、桑白皮等都每年的需求量都很大，这些药材传统的药用部位都是其根部，大量的地上部分被丢弃，造成环境污染和资源浪费。根据植物遗传规律及次生代谢产物的分布，具有重要药理作用的药物往往不仅仅局限于某一器官，开展对此种药材的非药用部位进行研究具有重要意义[11-12]，本次研究结果对其他类似药材的二次开发具有实际的借鉴价值。