南方某铀矿山废水对生物的急性毒性研究

刘顺亮，陶峰,3，宋晓红, 孙占学,*

1. 东华理工大学 核资源与环境省部共建国家重点实验室，南昌 330013 2. 桂林理工大学 环境科学与工程学院/广西环境污染控制理论与技术重点实验室, 桂林 541006 3. 湖南省核工业地质调查院, 长沙 410011

矿业是国家经济的重要来源，但由于矿山开采和金属冶炼过程中所产生的涉重废水、废渣、尾矿和降尘等废物长期未经处理且存在无序排放和堆存现象，对矿区附近的河域、农田土壤造成了严重的重金属污染，给人类的生产生活和健康造成严重威胁，也对环境生态系统具有巨大的潜在风险[1]，故开展矿山废水对水生生物的毒性研究具有重要的理论与应用价值。

目前，国内外学者在水生生物急性毒性研究中，孙翰昌等[2]曾探讨过Cu2+、Cd2+、Zn2+、Pb2+4种重金属对禾花鲤胚胎的毒性效应；朱丽娜等[3]和童中华等[4]利用青海弧菌Q67检测了印染废水的毒性，结果表明发光细菌法比化学参数法更能准确反映废水的毒性。Fulladosa等[5]曾以费氏弧菌作为测试对象，研究Zn2+- Pb2+等毒性重金属混合物的联合效应，发现Zn2+- Pb2+间存在协同效应。在低剂量辐射方面，赵维超等[6]、颜末等[7]、Kudryasheva等[8]和Selivanova等[9]分别以青海弧菌Q67和海洋发光菌的生物发光强度作为生理活性的标记物，研究了低剂量γ辐射和α、β辐射对菌体发光强度的抑制效应，发现发光强度与辐射时间呈负相关趋势，随辐射时间增加，抑制程度不断增强。但这些关于不同类型重金属和金属化合物对发光菌的生物毒性效应的研究，大多停留于非放射性元素或者某一种单独辐射方式的研究，而关于实际铀矿山类放射性废水对禾花鲤及发光菌的胁迫作用与毒性研究还未见报道。

传统的生物毒性研究大多停留在以单一化学物质或几种混合化学物质为研究对象，而开展污染物的联合毒性效应研究能更真实地反映环境的综合毒性。本研究拟通过发光细菌青海弧菌(Vibrio qinghaiensis Q67)和费氏弧菌(Vibrio fischeri)以及禾花鲤作为受试生物代表，以实地采集的矿山废水进行现况模拟开展铀矿山废水的联合生物毒性研究，对矿区废水进行全面的毒性评价，为矿区废水的安全处理处置、降低其生态风险提供参考依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 废水的采集与配制

试验所用矿山废水采自南方某铀矿工作区，样品中重金属离子铅、铀的含量检测参考陈永欣等[10]在铜锍中镉砷铅锌测定的预处理及测定方式(Optima7000DV等离子体发射光谱仪，美国PerkinElmer公司)。最后综合检测数据和矿区周围水域环境监测数据，在采集的矿山废水中按照其Pb2+/U6+实际比例等比加入Pb(NO3)2(GR，西陇化工有限公司)和U3O8(PT，北京中科质检生物技术有限公司)，配制成一定浓度的废水母液，以备后期的毒性实验。

1.2 菌种与培养

青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis Q67)和费氏弧菌(Vibrio fischeri)冻干粉购自华东师范大学生物系，其相关培养基配方及细菌培养方法分别见文献[11]和[12]。

1.3 发光细菌急性毒性试验

以青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis Q67)和费氏弧菌(Vibrio fischeri)作为废水急性毒性试验指示生物，通过微板分析方法[13]测定菌体在不同浓度胁迫环境中的发光强度。最终利用对数间距法对预试验结果进行数据处理，依次形成9个等比稀释序列作为正式实验中两类菌急性毒性试验浓度，青海弧菌急性毒性试验中Pb2+/U6+浓度由大到小依次为2.041/1.020 mg·L-1、1.885/0.943 mg·L-1、1.742/0.871 mg·L-1；费氏弧菌8.498/4.249 mg·L-1、6.700/3.350 mg·L-1、5.282/2.641 mg·L-1，以此类推；其中测试废水对青海弧菌急性毒性时，采用超纯水将废水稀释至实验所需浓度，费氏弧菌测试采用3%的氯化钠溶液进行稀释。

每个浓度点系列设置3个平样，平行试验测定结果之间的标准偏差≤ 10%。在加好菌种(青海弧菌Q67为100 μL、费氏弧菌100 μL)的测量管中，加100 μL调节好渗透压的样品，用复苏稀释液作空白对照，菌种与样品混合后震荡混匀，充分反应15 min后，利用多功能微孔板检测仪(BioTek-Synergy H4，美国Biotek公司)测定不同浓度组发光值，推算出抑制率，探讨废水对青海弧菌Q67和费氏弧菌的联合急性毒性效应，得出此类矿山废水对2种发光细菌的EC50。

1.4 鱼类急性毒性试验

试验所用禾花鲤幼鱼购自广东某渔场，实验前暂养2周，每日定时投食(螺旋藻育成锦饲料)一次，实验前停食1 d。挑选健康、活力强、规格相近的个体作为试验对象，平均体重(0.24 ± 0.05) g，平均体长(5.0 ± 0.2) cm。实验用水均为经曝气72 h除氯的自来水，pH 7.12～8.06，溶解氧 6.0 mg·L-1以上。实验容器为30 L体积均一的方形收纳箱，室内空调控温，水温控制在(13 ± 1) ℃。

正式实验根据预试验结果，包括96 h全部存活质量浓度上限(Pb2+/U6+=1.500/0.750 mg·L-1)和24 h全致死质量浓度下限(Pb2+/U6+=8.496/4.249 mg·L-1)，按等对数间距设置6个试验浓度，每个容器放置幼鱼10尾，并按鱼水比为1:3的比例进行废水添加，每组设置3个平行试验，同时设1个未染毒组为空白对照。试验采用静水生物测试法，试验期间不喂食，试验开始8 h内连续观察幼鱼行为、中毒及死亡症状，统计24 h、48 h、72 h和96 h时禾花鲤幼鱼的死亡情况，并计算出死亡率、LC50和SC。观察期间需及时清除死亡个体，判断幼鱼死亡的依据是呼吸停止，丧失游动能力，用镊子夹住鱼尾部5 min内鱼无反应[13]。

1.5 数据处理

针对矿区废水对青海弧菌Q67和费氏弧菌的急性毒性试验结果，采用Origin软件对发光抑制率与废水浓度数据进行非线性函数拟合，得到其“剂量-效应”关系曲线、拟合函数及拟合参数，计算出矿区废水对2种试验菌的毒性效应浓度EC50[14]。

试验所得数据均采用SPSS 17.0软件进行统计分析。根据矿区废水对禾花鲤幼鱼的急性毒性试验结果，用概率单位回归法[15]求出24 h、48 h、72 h、96 h试验鱼的半致死质量浓度(LC50)，并给出LC50的95%置信区间，并求出安全质量浓度SC。安全质量浓度按照特伦堡公式计算[16]：

SC=0.3×48 h-LC50/24 h-LC50/48 h-LC50

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 矿山废水对青海弧菌Q67、费氏弧菌的急性毒性效应

图1和图2分别展示了矿山废水对青海弧菌Q67与费氏弧菌的急性毒性实验结果，结果表明，矿山废水对Q67和费氏弧菌的毒性存在显著的“剂量-效应”关系，说明这2种发光细菌都能快速检测矿山废水的毒性。随着废水浓度的升高，2类细菌的发光强度逐渐降低，抑制效应不断加强。2类细菌对废水毒性敏感度之间存在较大差异，在低浓度范围内，即铀含量为0～0.804 mg·L-1时，费氏弧菌的生长繁殖活动等受影响较小，然而对Q67却呈现出很高的抑制率，高达90%；铀含量为0.804～2.082 mg·L-1时费氏弧菌发光抑制率急剧增大，废水的毒性水平明显提高，抑制率接近84%，Q67生长繁殖能力已完全丧失；随着废水浓度的继续升高，费氏弧菌的发光抑制率增势减缓，抑制率最大值为97%。通过非线性函数拟合，废水对青海弧菌Q67和费氏弧菌的毒性效应浓度EC50分别为1.339 mg·L-1Pb2+、0.669 mg·L-1U6+和2.284 mg·L-1Pb2+、1.142 mg·L-1U6+。青海弧菌Q67的灵敏度较高，能更好地表征矿山废水的毒性效应，可作为评价矿山废水毒性风险的有效指示物。

图1 矿山废水对青海弧菌Q67发光抑制率的影响Fig. 1 The inhibitory effects of mining wastewater on the luminescence of Vibrio qinghaiensis Q67

2.2 矿山废水对禾花鲤幼鱼的急性毒性效应

如图3所示，在矿山废水对禾花鲤幼鱼的急性毒性效应研究中，各胁迫时间内未污染对照组受体死亡率均为0，实验组受体死亡率与矿山废水之间呈现出很强烈的时间-剂量-效应关系的特征。主要表现为随着废水浓度增加和胁迫时间的延长，试验受体存活率大大降低，说明矿山废水对受体具有一定的毒害效应。实验初期，高浓度组中受体表现出高频运动和呼吸的机体行为以适应环境的变化；随着胁迫时间的推移，受体呈现出不同程度的中毒特征，严重时受体表现出运动迟钝，体色变白，身体逐渐卷曲并失去平衡的行为，直至死亡。容器底物和受体表面积聚大量淡黄色粘性物质。这与多篇报道的结果相一致[17-18]。

经过计算，废水对禾花鲤幼鱼24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分别为6.052 mg·L-1Pb2+-3.026 mg·L-1U6+、2.551 mg·L-1Pb2+- 1.275 mg·L-1U6+、1.979 mg·L-1Pb2+- 0.989 mg·L-1U6+和1.500 mg·L-1Pb2+- 0.75 mg·L-1U6+，安全浓度为0.136 mg·L-1Pb2+- 0.068 mg·L-1U6+。

图2 矿山废水对费氏弧菌发光抑制率的影响Fig. 2 The inhibitory effects of mining wastewater on the luminescence of Vibrio fischeri

图3 矿山废水对禾花鲤死亡率的影响Fig. 3 Effects of mining wastewater on the mortality of Procypris merus

3 讨论(Discussion)

3.1 铀矿山废水对2种发光细菌的急性毒性效应

发光细菌毒性试验是快速检测水体中污染物综合毒害效应的有效方法，目前已广泛应用于各种水质综合毒性检测中[3]。国内外学者利用发光细菌毒性试验开展了单一金属和混合物联合毒性的研究，朱丽娜等[3]和童中华等[4]利用青海弧菌Q67检测了印染废水的毒性，结果表明发光细菌法比化学参数法更能准确地反映废水的毒性。Fulladosa等[5]曾以费氏弧菌为测试对象，研究Zn2+- Pb2+等毒性浓度重金属混合物的联合效应，其发现Zn2+- Pb2+间存在协同效应。在实际环境中，共存的重金属种类繁多，仅通过简单的混合研究难以代表实际的环境，本研究中EC50较国内相关研究及国外Microtox体系结果小，这主要说明了重金属离子对菌种的毒害具有叠加效应。因此，本文采用实际矿山废水模拟开展联合毒性研究，能更真实地评价环境中重金属的毒性水平。

在本文中，矿山废水对青海弧菌Q67和费氏弧菌的毒性均存在显著的剂量-效应关系，且其效应能够在短时间内(15 min)显示，说明这2种发光细菌都能快速检测矿山废水的毒性。但比较2种细菌在矿山废水的急性毒性测试中的毒性效应浓度EC50可以发现，青海弧菌Q67的毒性效应浓度EC50远远低于费氏弧菌，说明青海弧菌Q67的灵敏度较高，能更好地表征矿山废水的毒性效应，可作为评价矿山废水毒性风险的有效指示物。

3.2 铀矿山废水对禾花鲤幼鱼的急性毒性效应

污染物对生物的毒害效应受污染物的理化性质、暴露水平和暴露时间等因素的共同影响[19]，本文中矿山废水对禾花鲤幼鱼死亡率的影响呈现明显的时间-剂量-效应关系，处理组中禾花鲤幼鱼的死亡率随着废水浓度的升高和处理时间的延长而上升，这与多篇报道的结果相一致[18-19]。孙翰昌等[2]曾研究了Cu2+、Cd2+、Zn2+、Pb2+4种重金属对禾花鲤胚胎的单一毒性与联合毒性，发现不同重金属离子的联合毒性具有协同作用，能增强其对禾花鲤胚胎的毒性。在铀矿山废水中铅和铀离子浓度较高，其对生物的联合毒性应引起重视。本研究中，废水对禾花鲤幼鱼的24 h和48 h半致死浓度及安全浓度均远高于孙翰昌报道的禾花鲤胚胎的数据，可能是由于幼鱼对外源污染物的抵抗力高于胚胎，另外也可能与供试废水成分和实验条件等有关。

综上所述：

通过3种受试水生生物的急性毒性研究发现，铀矿山废水对水生生物的毒性存在显著的剂量-效应关系，3种受试对象均可有效指示矿山废水的毒性水平，三者的毒性效应浓度EC50(LC50)的大小顺序为禾花鲤幼鱼>费氏弧菌>青海弧菌Q67，Pb2+/U6+浓度分别为6.052/3.026 mg·L-1、2.284/ 1.142 mg·L-1、1.339/0.669 mg·L-1，说明发光细菌能更灵敏地检测矿山废水的毒性水平，其中青海弧菌Q67能更好的表征矿山废水对环境生物的胁迫效应。实际工作中，可通过发光细菌和鱼类的急性毒性试验两者相结合，综合性地对矿山废水的毒性风险进行评价。