白洋淀底栖藻类与多环芳烃生态风险相关性研究——基于综合生物反应指数法

秦珊，张璐璐,2,*，崔建升,2，李双江,2

1. 河北科技大学环境科学与工程学院，石家庄 050018 2. 河北省污染防治生物技术实验室，石家庄 050018

湖泊生态系统服务功能对社会经济可持续发展极其重要[1]。但近年来，随着工农业迅速发展，导致湖泊生态系统中持久性有机污染程度增加[2]。其中，多环芳烃(PAHs)作为一类重要的持久性有机化合物，具有分布范围广、持久性强、远距离运输能力、以及致癌、致畸、致突变性等特点而广泛受到关注[3]，美国环境保护局(USEPA)将16种PAH化合物作为优先控制污染物。在中国，湖泊生态系统中的多环芳烃污染逐渐受到关注[4-6]。

当进行大量、大规模的样品分析时，需运用化学分析方法。但运用传统化学分析方法来检测环境介质(如水和沉积物)中的PAHs浓度，虽然可直接揭示环境中PAHs污染状况，但该方法不能建立PAHs污染与生物个体、种群、群落和生态系统之间生态效应的量化关系[7-8]。因此，需要构建一种有效的方法来建立PAHs污染水平与生物生态效应之间的量化关系[9-14]。与传统的理化分析方法相比，基于生物指示物的生态监测方法具有灵敏度高，整合度好，实用性强等优点[15]。生态监测方法主要是基于生物指示物来监测和记录生物对环境变化的响应。这些生物指示物包括鱼[16]、植物[17]、硅藻[18]、大型水生植物[19]、浮游植物[20]、鸟[21]、大型底栖生物[22]、底栖藻类[23]和其他物种[24]。

其中，底栖藻类在浅水湖泊生态监测中具有许多优势：它具有分布广；作为食物网的主要初级生产者[25-26]，在物质循环中发挥重要作用；对环境变化极其敏感[27-28]。目前，自然环境中有关短期多环芳烃污染对底栖藻类群落的生态影响关注较少。此外，在PAHs生态效应评估中，需考虑湖泊富营养化水平，有研究结果表明，营养水平可能会影响污染物的生物有效性与迁移转化过程，污染水平也可能通过影响初级生产者进而间接影响富营养化状况。因此，本研究选取底栖藻类作为生物指示物[29]，构建富营养化条件下PAHs生态效应的评估方法。本研究目的为：(1)白洋淀多环芳烃生态风险评估；(2)基于底栖藻类群落的综合生物反应指数(The Integrated Biomarker Response，IBR)计算；(3)建立PAHs生态风险指数与IBR之间的相关关系。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 湖泊的物理和化学特性1.1.1 白洋淀的物理特征

白洋淀(38°44′～38°59′N，115°45′～116°06′E)地处我国河北省保定市(图1)，面积约有366 km2。近10年来，由于人口数量的迅速增长和经济快速发展，白洋淀流域受人为干扰影响强烈。府河是白洋淀现今唯一的流入源，但府河作为保定市的城市排污河，会将含有大量污染物的城市污水汇入白洋淀。此外，淀区的生活污水、水产养殖、农业的非点源污染的过量营养物质直接排入到湖泊中，致使白洋淀湖泊呈中度营养-富营养状态，对湖泊生态系统健康有严重的负面影响。本研究选取8个国控点作为采样点，将采样点划分为3类生境：生境1为主要遭受城市污水(S1和S2)影响；生境2为主要遭受水产养殖和生活污水影响(S3、S6和S8)，生境3为遭受人为干扰较少(S4、S5和S7)。采样时间由底栖藻类群落的发展情况而定，分别于2009年6月下旬、8月下旬、11月初采集底栖藻类样品。

图1 白洋淀采样点分布图注：S1-府河入淀口，S2-南刘庄，S3-王家寨，S4-烧车淀，S5-枣林庄，S6-圈头，S7-采蒲台，S8-端村。Fig. 1 The sampling sites for Baiyangdian LakeNote: S1-Fuhe Inlet，S2-Nanliuzhuang，S3-Wangjiazhai，S4-Shaochedian，S5-Zaolinzhuang，S6-Quantou，S7-Caiputai，S8-Duancun.

1.1.2 水和沉积物的物理化学特征

用低密度聚乙烯容器采集5个4 L湖水样品，适当地过滤(0.2 μm过滤器)，在采样地和实验室冷却保存直至分析，在现场直接测量水深(WD)、温度(T)、pH和溶解氧(DO)。根据标准方法(CBEP—2002)测定氨氮(NH4-N)、化学需氧量(CODMn)、生化需氧量(BOD5)和其余水质参数。用碳分析仪测定总有机碳(TOC)。通过NH4-N、CODMn、BOD5和DO实测值归一化和求和来计算营养状态指数(TSI)[30-31]。除温度和pH值外，白洋淀中其余水体理化参数的均值均超出地表水标准(GB 3838—2002) (表1)。

将沉积物样品用聚乙烯塑封袋包装、封口标记、冷藏并送至实验室分析。将干燥后的样品转移至玻璃盘中，筛选去除石块、木屑、动植物残体等异物，用聚乙烯袋保存备用。沉积物样品用木制滚筒研磨，直到细颗粒<0.149 mm。pH测量使用玻璃pH电极测量[32]。TN和TP按照标准方法(GB 7173—1987和GB 9387—1988)测定。土壤有机碳含量采用重铬酸钾法测定[33]，总有机碳(TOCs)、溶解性有机碳(DOC)、有机质(OM)和腐殖质(Hu)根据相关标准方法进行测定(GB 9834—1988，GB 7857—1987和GB 7858—1987)(表2)。

1.1.3 白洋淀中多环芳烃浓度

将采集的沉积物样品放入冷冻干燥机中冷冻干燥并研磨成粒状粉末，通过100目尼龙筛网。依据美国环境保护局(USEPA)3545(加压流体萃取)、3630C(硅胶净化)和3660B(硫清除)的改进方法提取沉积物中多环芳烃。将捣碎的样品与无水硫酸钠以5:1的质量比进行混合，再与活化铜片以约1:1的比例混合，使得提取物脱硫。在125 ℃的温度和1 500 psi的压力下，用正己烷：二氯甲烷(1:1体积比)的加速溶剂并用快速溶剂萃取仪(ASE300，Dionex，Sunnyvale，CA)萃取10 min后提取混合物(2个静态循环)，用旋转蒸发器将提取物浓缩至约2 mL，通过装有无水硫酸钠的硅胶柱纯化，再用10 mL正己烷溶剂冲洗柱子去除非PAHs杂质。然后用15 mL二氯甲烷和正己烷(1:1，V/V)的混合溶剂洗脱，收集含有PAHs的第二洗脱液并使用旋转蒸发器浓缩。最后在容器中，运用氮气将流出物减少至0.5 mL左右，并通过正己烷调节至1.0 mL用于GC-MS分析。按顺序检测出15种PAHs分别是：萘(Nap)、Ace-萘(Acy)、苊(Ace)、芴(Flo)、菲(Phe)、蒽(Ant)、荧蒽(Fla)、芘(Pyr)、苯并(a)蒽(BaA)、苯并(b)荧蒽(BbF)、苯并[k]芴(BkF)、苯并[a]芘(BaP)、茚并[1,2,3-cd]芘(IcdP)、二苯并[a，h]蒽(DahA)、苯并[ghi]苝(BghiP)。其中PAHs浓度如表3所示。

表1 白洋淀不同时空水体主要理化参数(平均值)Table 1 Time course (mean values) of water chemical and physical attributes at the different habitats for the Baiyangdian Lake

表2 白洋淀不同时空沉积物主要理化参数(平均值)Table 2 Time course (mean values) of sediment chemical and physical attributes at the different habitat for the Baiyangdian Lake

表3 白洋淀不同时间和生境沉积物中15种重要PAHs含量(平均值，ng·g-1)Table 3 Time course (mean values, ng·g-1) of sediment 15 priority PAHs at the different habitat for the Baiyangdian Lake

续表3种类Types生境Habitat2009年4月April-20092009年8月August-20092009年11月November-2009ΣPAHs1846.80922.90770.702441.88527.70478.503414.33413.10377.30

1.2 白洋淀底栖藻类收集与指标分析

1.2.1 底栖藻类收集

为了收集底栖藻类样品，将3个由碳纤维(长10 cm，宽2 cm)组成的采集装置分别垂直固定在各采样点芦苇床附近水面下20 cm处，于湖水中暴露21 d。采集到的底栖藻类用0.2 μm滤膜过滤后的样点水悬浮，其中一份加入5%甲醛固定，用于底栖藻类鉴定；其余所有样品用冰盒保存并带回实验室分析。分别取3份底栖藻类平行样品，2 mL蒸馏水悬浮，然后用孔径为0.2 μm的玻璃纤维膜过滤，称重，105 ℃干燥24 h后称重，在500 ℃马弗炉内烘干1 h后称量样品灰，计算无灰干重，计算结果以g·m-2为单位[31]。

1.2.2 底栖藻类指标分析

使用生长在碳纤维上的底栖藻类样品用于属性测定分析(TK-1600，江苏同康活性炭纤维有限公司；比表面积：1 450～1 550 m2·g-1；孔径：18～21 Å。用于测定结构(叶绿素、无灰干重、藻密度和多糖含量)和功能属性(胞外酶活性)的样品在黑暗的冷却箱中运送到实验室。用于测定叶绿素和多糖含量的样品保持冷冻直至分析。测定无灰干重(AFDW)、叶绿素浓度、多糖含量(PSC)、胞外酶活性、藻密度和成分的分析计算方法[31]列于表4中。

1.3 综合生物反应指数(IBR)计算

1.3.1 计算方法

为了计算综合生物反应指数(表5)，计算不同时空条件下的IBR值[34]，步骤如下：(1)计算各个采样点生物标志物(X)的平均值和标准偏差(SD)；(2)生物标志物数据标准化：Y=(X-平均值)/ SD，其中X是每个采样点生物标志物值，平均值是所有采样点生物标志物的平均值，SD是标准偏差；(3)在应对激活或抑制的生物学效应的情况时，Z = Y或Z = -Y。选取采样点中每个生物标志物的最小值加到Z中；(4)标准分数(S)计算公式为S = Z + | Min |，其中S≥0并且取| Min |绝对值。

由于所有生物标志物都以上述方式处理，因此可使用星图来显示生物标志物结果，其中半径坐标(Si)表示给定生物标志物在特定位置的得分，星图的面积根据公式获得[34]：

(1)

其中，Ai是顺时针顺序连接星图的第i个和第(i+1)个半径坐标的个体区域；Si和Si+1是标准生物标志物得分，第i个和第(i+1)个星图半径坐标；n是调查中生物标志物的数量。

1.3.2 底栖藻类群落的IBR计算

表5中给出了生物标志物的平均值、每个生物标志物的总体平均值和标准差值。利用该表给出的2009年4月生境1的数据计算生境1的综合生物反应指数值(表6)并按数据的结果绘图(图2)。 然后计算相应IBR值：IBR04/2009H1 = A1 + A 2+ A3 + A4 + A5 +A6 + A7 + A8 + A9 + A10 + A11 + A 12= 7.64，其中A1 =(S1S2)/2=0.03，A2 = 0.03，A3 = 0.57，A4 = 0.87，A5 = 1.45，A6 = 3.28，A7 = 0.72 ，A8 = 0.04，A9 = 0.03，A10 = 0.19，A11 = 0.22，A12 = 0.21。

1.4 多环芳烃生态风险评估

为了评估白洋淀中PAHs潜在的生态风险，本研究将沉积物中检测到的PAHs含量与其相应的质量值进行比较[35]，风险熵(RQ)表征部分PAHs的风险水平，计算公式如下：

图2 2009年4月H1生物标志物星图Fig. 2 Examples of a biomarker star plot for station H1 in April 2009

表4 底栖藻类群落指标计算方法Table 4 The ecological metrics for IBR based on periphyton community

表5 白洋淀不同时空底栖藻类结构和功能指标(平均值)Table 5 Time course (mean values) of periphyton structural and functional metrics at the different habitat for the Baiyangdian Lake

表6 2009年4月白洋淀的H1的IBR计算实例Table 6 The score for IBR of station H1 in the Baiyangdian Lake, April 2009

(2)

其中CPAHs是介质中部分PAHs的浓度；CQV是介质中部分PAHs的质量值[35]。

以上方法只能评估9种PAHs的生态风险，为了能够评估其他6种PAHs的生态系统风险，本研究采用单个PAHs的毒性等效因子(TEFs)[36]来推断Acy、Ace、Flo、Pyr、BbF和DahA的NC和MPC值(表7)。根据此前的方法，RQΣPAHs、RQΣPAHs(NCs)和RQΣPAHs(MPCs)定义如下：

(3)

(4)

(5)

图3 白洋淀各采样点单一生物标志物星状图注：AP-H1、AP-H2、AP-H3，AU-H1、AU-H2、AU-H3，NO-H1、NO-H2、NO-H3表示2009年4月、8月、11月的3种生境。Fig. 3 Station star plots for each biomarker and survey in the Baiyangdian LakeNote: AP-H1, AP-H2, AP-H3; AU-H1, AU-H2, AU-H3; NO-H1, NO-H2, NO-H3 stand for Habitat 1, Habitat 2, Habitat 3 studied in April, August, November 2009.

基于对16种PAHs的生态风险评估，总和大于1的PAHs的RQ(NCs)和RQ(MPCs)，计算出ΣPAHs的RQΣPAHs(NCs)和RQΣPAHs(MPCs)。

1.5 统计分析

为了建立多环芳烃生态风险与综合生物反应指数之间的相关关系，本研究采用Pearson(SPSS 16.0)相关分析非正态分布数据，显著性水平表示为P<0.05，P<0.01或P<0.001[37]。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 白洋淀理化参数

在2009年4月—11月，3个生境中水温(T)的变化范围为17.50 ～29.50 ℃，仅存在轻微的季节变化；而pH值相对稳定。就空间变化而言，WD、透明度(Trans)和TOC在生境1中相对较低，而TSI、TN和TP在生境1中相对较高。表2中数据表明，在空间分布上沉积物主要理化参数也存在显著空间差异，生境1中所有的指标都高于生境2和3。

2.2 底栖藻类IBR2.2.1 单一生物标志物时空变化

从底栖藻类群落指标的季节变化而言，AD、Chl a、Chl b/a、CHL、CYA、APA、GLU、LEU、PSC和AFDW的值在11月最高，其次是8月和4月；就空

间分布特征而言，这些指标值在生境1中最高。而Chl c/a和BAC的值在8月最高，其次是11月和4月，从空间分布特征而言，Chl c/a和BAC指标值在生境3最高(图3)。相关分析的结果表明Chl a、Chl b/a、CHL、CYA、APA、GLU、LEU、PSC和AFDW的指标与PAHs污染物浓度呈显著正相关，而Chl c/a和BAC指标与污染物PAHs浓度呈显著负相关(表3)。

2.2.2 不同生物标志物的时空变化

从白洋淀生物标志物星图(图4)可以发现在4月，星状图面积最大值出现在生境3(H3)，生境1(H1)和生境2(H2)的面积相对较低。在8月和11月生境1的星状图面积大于生境2和生境3。

表8 每个样点和调查的综合生物标志物响应(IBR)Table 8 Integrated biomarker response (IBR) for each station and survey

图4 白洋淀各采样点不同生物标志物星状图Fig. 4 All biomarker star plots for station and survey in the Baiyangdian Lake

表9 白洋淀不同时间和生境中15种PAHs生态风险(平均值)Table 9 Time course (mean values) of ecological risk for 15 PAHs at the different habitats for the Baiyangdian Lake

2.2.3 IBR比较

白洋淀各采样点综合生物反应指数值见表8。结果表明：在4月、8月和11月，生境1的IBR值高于生境2和生境3；生境1的IBR最高值出现在8月，表明其活跃度较高。在4月、8月和11月，生境3的活跃程度低于生境1和生境2，但生境1的最大面积表明其生物指标值始终最高。

2.3 白洋淀多环芳烃生态风险评估2.3.1 多环芳烃浓度时空变化

白洋淀沉积物中15种主要PAHs(ΣPAHs)的浓度范围为377.30～922.90 ng·g-1。就空间分异特征而言，生境1中的ΣPAHs浓度最高，表明人为干扰程度直接影响PAHs的空间分布。就季节变化而言，PAHs的浓度从4月到8月逐渐增加，而从8月到11月逐渐下降。各类PAHs表现出与ΣPAHs相同的时空变化特征(表3)。除BbF、Bap、IcdP和BghiP外，大部分PAHs具有显著相关性(r=0.681～0.991)，这一现象可以用PAHs在地球化学和人为污染的不同来源解释。

2.3.2 白洋淀PAHs生态风险时空变化

不同时空条件下RQ(NCs)和RQ(MPCs)值见表9。结果表明：BaA、BbF、BaP和IcdP是RQΣPAHs(NCs)的主要贡献者，但在不同时空条件下仍存在差异。RQΣPAHs(NCs)的时空变化趋势与人为干扰程度直接相关，而RQΣPAHs(MPCs)在时空分布上无显著差异(表10)。

2.4 白洋淀PAHs生态风险与底栖藻类IBR的相关性分析

本研究旨在建立底栖藻类IBR与ΣPAHs生态风险间可能存在的相关性。IBR与RQΣPAHs(NCs)均呈现显著的时空分异规律，运用Pearson相关性分析，结果见表10。IBR与RQΣPAHs(NCs)呈正相关关系(r=0.827，P<0.01)；除RQAcy(NCs)外，其他种类PAHs生态风险均与IBR呈正相关关系(r=0.699～0.899)，其中RQBaP(NCs)与IBR显著正相关(r=0.899，P<0.01)。此外，除沉积物TP外，IBR与TSI、水中TN、水中TP和沉积物TN也呈显著正相关(r=0.722～0.862)。因此，在富营养化湖泊中应考虑运用底栖藻类IBR进行生态监测PAHs污染水平。

2.5 底栖藻类群落指标与污染物毒性相关性研究

底栖藻类在水生态系统中作为主要的初级生产者，因此在营养循环和化学物质迁移转化过程中发挥重要的作用[38]。由化学物质引起的底栖藻类群落结构变化可以揭示污染物对生物群落的间接效应，而这些间接效应无法通过对单一物种的毒性测试获取，因此底栖藻类群落在群落尺度下的生态毒理学研究中具有极其重要的特征[39]。Guash等[40]的研究结果表明，底栖藻类暴露在三氯生中会导致生产力下降，因为三氯生的毒性会抑制藻类被摄食后的再次生长和群落生物多样性下降。在这些综合因素的协同作用下，污染物的毒性效应可能会通过捕食压力的变化而放大对群落结构和生态系统功能(如：初级生产和营养循环)的影响。Pandey等[41]的研究结果表明，由于底栖藻类细胞内可以富集重金属(Cu, Zn和Pb)，进而抑制细胞生长，减少细胞数量，并增加硅藻的细胞膜变异，因此底栖藻类群落中硅藻细胞膜的形态变异可以作为监测河流中重金属污染的生态指标。

生物群落已广泛应用于持久性有机污染物的生态监测中，不同的生物指示物种已经被陆续应用于监测陆地环境中PCDD/Fs和PAHs的污染水平[42]，使用最广泛的为松针和蔬菜，但这些生物指示物种具有短期存在的特征，无法富集足够量的有机污染

表10 综合生物反应指数与PAHs生态风险之间的Pearson相关系数Table 10 The Pearson’s correlation coefficients between biotic metrics and risk indexes

注：*相关性在0.05水平显著，**相关性在0.01水平显著。

Note:*Correlation level at 0.05,**correlation level at 0.01.

物，因此无法显示POPs的长期慢性毒性效应。POPs在生态系统中处于低剂量长期暴露的特征，而藻类则具有长期存在，能够揭示POPs在自然生态系统中低剂量长期暴露的特征。其中，越来越多的研究表明，底栖藻类群落能够揭示POPs的生态效应[43]，Sabater等指出[44]，群落种类组成[45]、藻类色素或其光合能力[46]等指标都可以运用于建立POPs生态效应与底栖藻类群落结构和功能的相关性，并将底栖藻类群落作为POPs监测的预警指示物种。

综上所述：

底栖藻类作为一种生物指示物，已广泛应用于污染物的生态监测中。但在生态系统尺度下，污染物的毒性效应与底栖藻类群落结构和功能指标之间的相关性研究还较为缺乏。本研究选取富营养化湖泊——白洋淀作为研究区，选取底栖藻类群落作为生物指示物，以PAHs作为污染物，通过相关性分析，建立了IBR与PAHs生态风险的相关关系，研究结果表明基于底栖藻类群落的IBR指数与PAHs的生态风险呈现显著相关性，因此，在富营养化湖泊中应考虑运用底栖藻类IBR生态监测PAHs污染水平。