布洛芬对活性污泥中功能酶活性的影响

赵晶晶，董玉瑛，方政，邹学军

大连民族大学 环境与资源学院，大连116605

医药品、个人护理品以及内分泌干扰物等新型有机污染物(emerging organic contaminants，EOCs)多为具有生物活性物质，其进入水体环境，可诱发水生生物发生不同应激变化，对生态环境和生物健康的危害风险较大[1]。其中布洛芬(IBP，C13H18O2)是具有抗炎、镇痛、解热作用的常用非甾体抗炎药，使用剂量较大，达1 200 mg·d-1[2]，同时已有研究在不同来源水体中检测到其存在[3-5]。各类有机物需进入城市污水厂经生化处理达标后排放，其过程中稳定的污泥处理效果是保障出水水质达标的重要基础，而污水处理厂污泥中存在着数量众多、遗传与代谢方式多样的微生物，它们在污染物的去除中发挥着关键驱动作用。但微生物无法完全去除大部分新型有机污染物，如国内污水处理厂布洛芬的去除率约为41.6%[6-7]，去除率低。并且新型有机污染物多具有生物毒性[8-9]，会影响水处理效果。已有研究发现，污水中的有毒物质超过一定浓度时，会影响和干扰微生物的正常代谢，进一步影响污水生物处理效果[10]。

不同酶的功能有特异性，是污泥活性的直接反应。活性污泥生物代谢功能与一系列酶活性密切相关[11]。这些酶担负着净化污水的使命，同时其功能也会受到污水中具有生物活性EOCs存在的影响[12]。因此，测定EOCs对污泥微生物群落的影响、筛选影响污泥生态功能的敏感指标，可及时预警污水处理系统污泥活性出现异动的情况。

因为如布洛芬的新型有机污染物使用量大、去除率低，且药品的存在会影响活性污泥微生物的活性，而传统的监测指标存在不足。所以需要筛选敏感污泥活性指标，以有效预测风险。研究通过将活性污泥暴露于布洛芬存在的条件下进行相关指标分析，主要选择活性污泥中脲酶活性、转化酶活性为主要分析指标。对各指标进行对比分析，为筛选敏感污泥活性指标、有效预测可能出现的环境风险提供基础数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与材料

UV-1000分光光度计(上海，美普达仪器有限公司)；THZ-B台式恒温振荡器(常州，诺基仪器有限公司)；PHP-9082型电热恒温培养箱(上海，一恒科技有限公司)；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海，精宏实验设备有限公司)。

实验用布洛芬购自海外制药有限公司。其他试剂均为分析纯。实验中所用活性污泥均取自大连某污水处理厂的曝气池，其基本理化指标：混合液悬浮固体(MLSS)1 609 mg·L-1；挥发性悬浮物(VSS)0.7 mg·L-1；污泥容积指数(SVI)80～120 mL·g-1；浊度3 500～3 700 mg·L-1，耗氧速率(OUR)3 mg·g-1·h-1。污泥在进行后续实验前进行充分的曝气培养。

1.2 生化指标分析方法

1.2.1 脲酶活性分析方法

脲酶的活性测定应用苯酚钠比色法[13]。通过多组空白试验，确定活性污泥脲酶活性的稳定时间段，根据实验时间要求控制污泥与药品的暴露时间。将污泥与0～40 μg·L-1的布洛芬等体积混合暴露。随后将污泥悬浊液与甲苯充分混合，加入10%的尿素溶液和柠檬酸缓冲溶液，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。取滤液加入苯酚钠和次氯酸钠，混匀后静置。溶液在稀释后于578 nm测吸光度。每组设置2个平行样。同时设置无土对照与无基质对照，用以检验试剂纯度和基质自身分解。无土对照即不加土样，其他操作与样品实验相同。无基质对照即以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

1.2.2 转化酶活性分析方法

转化酶的活性测定应用3,5-二硝基水杨酸法[13]。通过多组空白试验，确定活性污泥转化酶活性的稳定时间段，根据实验时间要求控制污泥与药品的暴露时间。将污泥与0～40 μg·L-1的布洛芬等体积混合，暴露15 h。随后将污泥悬浊液中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、10%的蔗糖溶液和甲苯溶液，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。取滤液加入3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴加热，然后冷却，稀释后于578 nm测吸光度。每组设置2个平行样。同时设置无土对照与无基质对照，用以检验试剂纯度和基质自身分解。无土对照即不加土样，其他操作与样品实验相同。无基质对照即以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

1.3 数据统计与分析

1.3.1 酶活性表征

活性污泥中酶活性的计算方法参关松萌[13]的酶活性计算方法。酶活性以24 h后1 g烘干污泥对应生成产物的质量表示。

脲酶活性以24 h后1 g烘干污泥对应NH3-N生成量的毫克数表示：

(1)

式中：a样品为样品吸光度值对应标准曲线求得的NH3-N毫克数；a无污泥为无污泥对照吸光度值对应标准曲线求得的NH3-N毫克数；a无基质为无基质对照吸光度值对应标准曲线求得的NH3-N毫克数；V为显色液体积(mL)；n为分取倍数，即浸出液体积/吸取滤液体积；m为烘干污泥的质量(g)。

转化酶活性以24 h后1 g烘干污泥对应葡萄糖生成量的毫克数表示：

(2)

a样品为样品吸光度值对应标准曲线求得的葡萄糖毫克数；a无污泥为无污泥对照吸光度值对应标准曲线求得的葡萄糖毫克数；a无基质为无基质对照吸光度值对应标准曲线求得的葡萄糖毫克数；V为显色液体积(mL)；n为分取倍数，即浸出液体积/吸取滤液体积；m为烘干污泥的质量(g)。

图1 酶活性与暴露时间关系Fig. 1 Relationship between enzyme activity and exposure time

图2 不同浓度布洛芬对污泥脲酶活性的影响Fig. 2 Effect of different concentrations of ibuprofen on urease activity

1.3.2 酶活性变化率分析

以布洛芬暴露浓度与酶活性的动态变化率、总变化率的剂量-效应关系表示酶活性在布洛芬暴露下的变化情况。

(3)

式中：R为酶活性变化率，Rn为本测定点酶活性值，Rn-1为上一测定点酶活性值，R0为布洛芬暴露浓度为零时的酶活性值。

酶活性动态变化率表达的是酶活性在本测定点与上一测定点区间内的变化情况，是对酶活性变化的动态分析，强调相邻测定点区间内的变化情况。

(4)

式中：I为酶活性抑制率，I0为布洛芬暴露浓度为零时的酶活性值，In为本测定点酶活性值。

酶活性总变化率表达的是酶活性在某一浓度点与零浓度点相比的变化程度，是对酶活性总体变化情况的分析，强调总体趋势。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 污泥酶活性稳定时间

通过多组空白试验数据，确定活性污泥酶活性的稳定暴露时间，发现对于脲酶活性，暴露时间为5 h时，脲酶活性总变化率为15.2%；暴露时间为30 h时，脲酶活性总变化率为22.4%；其余暴露时间下，脲酶活性较为稳定，总变化率不超过±3%。对于转化酶活性，暴露时间为30 h时，转化酶活性总变化率为16.7%；其余暴露时间下，转化酶活性较为稳定，总变化率不超过±6%。

因此我们选择暴露时间在脲酶和转化酶活性同时稳定的时间，并根据实验时间要求控制污泥与药品的暴露时间为15 h。

2.2 脲酶活性响应

脲酶(urease)是一种能促进含氮有机物水解的水解酶，对污水中含氮有机物的分解具有重要意义[14]。脲酶活性值与布洛芬浓度有显著的相关关系。脲酶活性动态变化率随布洛芬浓度升高先小幅度提升，在布洛芬浓度达到28 μg·L-1后呈现出了单调递减趋势。在布洛芬浓度达到35～40 μg·L-1时，对脲酶活性的抑制程度超过了40%。试验结果表明，28～40 μg·L-1的布洛芬对活性污泥微生物的脲酶活性有显著的抑制作用，随着暴露浓度的增加，持续表现出抑制。而布洛芬与脲酶活性总变化率的剂量-效应图表明，脲酶活性在0～40 μg·L-1的布洛芬暴露下总体为抑制作用，布洛芬浓度达28 μg·L-1后，

图3 不同浓度布洛芬对污泥转化酶活性的影响Fig. 3 Effect of different concentrations of ibuprofen on invertase activity

脲酶活性总变化率单调增加，存在显著的剂量-效应相关性。在布洛芬浓度达到40 μg·L-1时，脲酶活性总变化率超过了70%。实验结果表明，布洛芬胁迫浓度较低时，受外界条件刺激微生物代谢活性增强，微生物受到外界污染物影响时，为减少对自身的毒害，需要通过代谢作用将其分解，脲酶能促进含氮有机物的水解，当活性污泥中布洛芬胁迫浓度较低时，受外界条件刺激下，微生物代谢活性增强[15]，加速了布洛芬的降解和转化；而随着暴露浓度的继续增加，有毒物质导致了脲酶等水解酶的活性下降，脲酶的活性呈现单调递减趋势，这是因为当活性污泥中毒物质量过高时，会破坏微生物细胞结构，降低其氧化代谢能力。此在实验浓度范围内布洛芬的存在会影响脲酶分解含氮有机物的活性，诱导了不利应激变化。闫颖等[16]的研究也发现低浓度除草剂阿特拉津对土壤脲酶的活性有促进作用，而高浓度阿特拉津降低了脲酶的活性。

实验结果也解释了出水氨氮发生异常时，数据往往上升迅速的现象。通过对污染物对脲酶活性影响的分析，可较为准确和迅速地判断污水处理的异动情况。同时可以采取及时的控制措施，缩短系统的恢复时间。

2.3 转化酶活性响应

转化酶(invertase)可增加污泥中易溶性营养物质，对污泥中的碳循环有重要作用[17]。而转化酶活性值随暴露浓度增加活性总体趋于稳定，表现出良好的耐受性。转化酶活性动态变化率范围不超过±20%，转化酶活性总变化率的变化表明，与空白相比转化酶活性呈现出了一定的抑制现象，但总变化率变化趋势不明显。实验浓度范围内在布洛芬浓度为35 μg·L-1时转化酶活性总变化率达到峰值，但最大总变化率未超过30%。因此，转化酶活性对布洛芬实验范围内浓度变化不敏感。陈青林[18]的阿特拉津对土壤酶活性影响的研究也表明，土壤脲酶对阿特拉津的敏感程度大于转化酶对阿特拉津的敏感程度。

通过对比活性污泥中脲酶、转化酶的活性变化率在布洛芬0～40 μg·L-1暴露下的变化，我们发现：不同种类酶活性对布洛芬暴露的响应不同，随毒性作用的不断增强，脲酶活性先被激活，后被抑制；转化酶活性变化不明显。转化酶活性动态和总变化率波动幅度均低于脲酶活性动态和总变化率，因此转化酶活性指标在实验浓度范围内对布洛芬的敏感程度低于脲酶活性指标。脲酶活性在布洛芬较低暴露浓度下明显显示出抑制作用，且变化幅度大、响应快，因此推荐使用脲酶活性指标作为评价布洛芬等新型有机污染物对复杂污泥机制中活性污泥微生物活性影响的重要敏感酶指标。