大鼠被动皮肤过敏试验两种佐剂选择的探讨

曹 冲，张岱州，刘宜辉，庄 婕

（山东省药学科学院 山东省化学药物重点实验室，山东 济南 250101）

国家食品药品监督管理总局颁布的《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》[1]规定，通常局部给药发挥全身作用的药物需考察Ⅰ型过敏反应，如注射剂需进行被动皮肤过敏试验（PCA），通常选大鼠进行试验，剂量设计中应设立阳性对照组和阴性对照组。阴性对照组应给予同体积的溶媒，阳性对照组给予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质。

已有研究表明，大鼠PCA以卵白蛋白为致敏原时，需加入佐剂才能获得良好的免疫效果[2-4]。佐剂自身并无免疫原性，不能引起免疫应答，其主要作用是增强抗原的免疫原性，延长抗原在局部组组织中的停留时间，降低抗原降解速度。本试验选用卵白蛋白为致敏原，比较两种不同的佐剂类型──氢氧化铝佐剂和弗氏完全佐剂，在不同致敏剂量、不同致敏途径等可变因素下，对大鼠被动皮肤试验结果的影响，以便得出敏感性较高、结果较稳定的阳性对照。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACS-JJ型电子秤（梅特勒-托利多）；AUW-120D型电子分析天平（日本岛津公司）。

1.2 试剂

卵白蛋白（Sigma公司，批号：326A052）；0.9 %氯化钠注射液（青州尧王制药公司，批号：3217040804）；无水三氯化铝（国药集团，批号20150518）；氢氧化钠（国药集团，批号：20141011）；弗氏完全佐剂（Sigma公司，批号：SLBR3877V）。

1.3 动物

SD大鼠，SPF级，体重100～200 g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。大鼠饲养于SPF级动物房，实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）2014 0008，饲养室温度为20～26 ℃，日温差≤4 ℃，湿度为40 %～70 %。

2 方法

2.1 分组、致敏与致敏血清制备

72只大鼠随机分为12组，每组6只，抗血清制备阶段每组2只，被动致敏阶段每组4只，雌雄各半。以三氯化铝溶液和氢氧化钠溶液配成浓度约4 %的氢氧化铝凝胶佐剂，与卵白蛋白1:1比例混匀，弗氏完全佐剂原液与卵白蛋白1:1比例混匀，各组大鼠于第1，3，5天分别给予受试物与佐剂混合物1 ml，共致敏3次。末次致敏后第10天，各组大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠，麻醉后腹主动脉取血，2000 r/min离心10 min，分离血清，将同组动物的血清混合后装于EP管于当日使用。

2.2 被动致敏及激发

将大鼠背部脱毛，脱毛区域约5 cm×6 cm。同时用0.9 %氯化钠注射液稀释各组制备好的致敏血清，稀释度分别为原液、1:2、1:4、1:8。在脱毛不同区域的4个点按顺时针或逆时针方向皮内注射各稀释度抗血清进行被动致敏，每个注射点0.1 ml，每侧2个点，每点间隔约2～3 cm。皮内注射抗血清约24 h后，各组尾静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原，给予0.5 ml抗原加0.5 ml 0.5 %伊文思蓝混合后共1 ml的混合液[5]。

2.3 判断标准

抗原激发约30 min后，CO2麻醉处死动物，剪取背部皮肤，采用直接测量法测量皮肤内侧蓝斑的长径和短径，不规则斑点的直径为长径与短径的平均值。蓝斑直径在5 mm以上者判定为阳性[1,6]，同时阴性对照组在该稀释度下无蓝斑。

2.4 统计方法

蓝斑直径采用平均值±标准差（±s）表示，采用DAS 1.0软件进行统计分析，P≤0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 氢氧化铝佐剂大鼠腹腔致敏途径PCA结果

结果见表2。由表2可见，以氢氧化铝佐剂+0.9 %氯化钠注射液为抗原，各注射点均未出现蓝斑。以氢氧化铝佐剂+卵白蛋白为抗原，卵白蛋白剂量为10 mg/只和20 mg/只时，腹腔致敏途径下，各组动物均出现蓝斑，阳性反应率为100 %，且原液、1:2、1:4、1:8注射点蓝斑直径均＞5 mm，与阴性对照组比较，差异有高度统计学意义。卵白蛋白剂量为20 mg/只时的蓝斑直径大于卵白蛋白剂量为10 mg/只时的蓝斑直径。

表2 氢氧化铝佐剂大鼠腹腔致敏途径蓝斑直径（ ±s，n=4）

表2 氢氧化铝佐剂大鼠腹腔致敏途径蓝斑直径（ ±s，n=4）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.01

氢氧化铝佐剂+卵白蛋白 10 19.4±2.9*15.8±3.1*13.5±2.9*11.2±3.0*Ⅲ氢氧化铝佐剂+卵白蛋白 20 24.9±2.4*18.1±1.7*15.9±1.5*14.0±1.3*Ⅸ 氢氧化铝佐剂+0.9 %氯化钠注射液 - 0 0 0 0组别 致敏原 卵白蛋白剂量/mg·只-1 蓝斑直径/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅰ

3.2 氢氧化铝佐剂大鼠皮下致敏途径PCA结果

结果见表3。由表3可见，以氢氧化铝佐剂+0.9 %氯化钠注射液为抗原，各注射点均未出现蓝斑。以氢氧化铝佐剂+卵白蛋白作为抗原，卵白蛋白剂量为10 mg/只和20 mg/只时，皮下致敏途径下，各组动物均出现蓝斑，阳性反应率为100 %，且原液、1:2、1:4、1:8注射点蓝斑直径均＞5 mm，与阴性对照组比较，差异有高度统计学意义。大鼠在卵白蛋白剂量为20 mg/只时的蓝斑直径大于大鼠在卵白蛋白剂量为10 mg/只时的蓝斑直径。

表3 氢氧化铝佐剂大鼠皮下致敏途径蓝斑直径（ ±s，n=4）

表3 氢氧化铝佐剂大鼠皮下致敏途径蓝斑直径（ ±s，n=4）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.01

组别 致敏原 卵白蛋白剂量/mg·只-1 蓝斑直径/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅱ 氢氧化铝佐剂+卵白蛋白 10 20.1±2.0* 14.8±2.6* 12.8±1.7* 11.0±1.3*Ⅳ 氢氧化铝佐剂+卵白蛋白 20 23.4±2.0* 19.9±2.0* 17.5±2.6* 15.9±3.2*Ⅹ 氢氧化铝佐剂+0.9 %氯化钠注射液 - 0 0 0 0

3.3 弗氏完全佐剂大鼠腹腔致敏途径PCA结果

结果见表4。由表4可见，以弗氏完全佐剂+0.9 %氯化钠注射液为抗原，各注射点均未出现蓝斑。以弗氏完全佐剂+卵白蛋白作为抗原，卵白蛋白剂量为10 mg/只和20 mg/只时，腹腔致敏途径下，各组动物均出现蓝斑，阳性反应率为100 %，且原液、1:2、1:4、1:8注射点蓝斑直径均＞5 mm，与阴性对照组比较，差异有高度意义。卵白蛋白剂量为20 mg/只时的蓝斑直径大于卵白蛋白剂量为10 mg/只时的蓝斑直径。

表4 弗氏完全佐剂大鼠腹腔致敏途径蓝斑直径（ ±s，n=4）

表4 弗氏完全佐剂大鼠腹腔致敏途径蓝斑直径（ ±s，n=4）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.01

组别 致敏原 卵白蛋白剂量/mg·只-1 蓝斑直径/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅴ 弗氏完全佐剂+卵白蛋白 10 15.5±1.8* 12.2±0.8* 10.4±1.3* 8.6±1.6*Ⅶ 弗氏完全佐剂+卵白蛋白 20 18.4±2.9* 15.3±2.6* 12.1±1.6* 10.0±1.8*Ⅺ 弗氏完全佐剂+0.9 %氯化钠注射液 - 0 0 0 0

3.4 弗氏完全佐剂大鼠皮下致敏途径PCA结果

结果见表5。由表5可见，以弗氏完全佐剂+0.9 %氯化钠注射液作为抗原，各注射点均未出现蓝斑。以弗氏完全佐剂+卵白蛋白作为抗原，卵白蛋白剂量为10 mg/只和20 mg/只时，皮下致敏途径下，各组动物均出现蓝斑，阳性反应率为100 %，且原液、1:2、1:4、1:8注射点蓝斑直径均＞5 mm，与阴性对照组比较，差异有高度统计学意义。卵白蛋白剂量为20 mg/只时的蓝斑直径大于卵白蛋白剂量为10 mg/只时的蓝斑直径。

表5 弗氏完全佐剂大鼠皮下致敏途径蓝斑直径（ ±s，n=4）

表5 弗氏完全佐剂大鼠皮下致敏途径蓝斑直径（ ±s，n=4）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.01

组别 致敏原 卵白蛋白剂量/mg·只-1 蓝斑直径/mm原液 1:2 1:4 1:8Ⅵ 弗氏完全佐剂+卵白蛋白 10 14.2±2.1* 11.0±1.7* 10.4±1.8* 7.9±0.8*Ⅷ 弗氏完全佐剂+卵白蛋白 20 18.9±2.8* 12.9±2.6* 10.6±1.4* 9.3±1.5*Ⅻ 弗氏完全佐剂+0.9 %氯化钠注射液 - 0 0 0 0

4 讨论

PCA是药物非临床安全性评价的重要部分，试验操作简单，结果直观，已广泛用于过敏性评价试验中，有大量的背景数据。研究表明，不同品系的大鼠对药物的免疫应答敏感性不同，敏感性大小为SD大鼠＞F344大鼠＞Wistar大鼠[7]，因此本实验选用SD大鼠进行试验。王冲等[8]研究表明，在添加佐剂的情况下，可明显增加卵白蛋白的过敏反应敏感性，因此，大部分PCA试验都使用佐剂，王金华等[4]等研究表明，卵白蛋白对大鼠的免疫原性要优于牛血清白蛋白。传统佐剂主要有矿物质佐剂、油佐剂、微生物佐剂等[9]，因此本实验选用两种类型的佐剂，矿物佐剂氢氧化铝和油佐剂弗氏完全佐剂，抗原选用卵白蛋白，比较这两种佐剂在卵白蛋白10 mg/只、20 mg/只剂量下，腹腔和皮下两种途径对大鼠PCA结果的影响。结果表明，以氢氧化铝佐剂+卵白蛋白和弗氏完全佐剂+卵白蛋白作为抗原，3次致敏动物，各组动物均出现蓝斑，阳性反应率为100 %，且蓝斑直径均大于5 mm，蓝斑直径大小与稀释度呈负相关，稀释度越大，蓝斑越小，即蓝斑直径大小原液＞1:2＞1:4＞1:8。佐剂、卵白蛋白剂量、致敏途径等因素不同，各注射点的蓝斑直径大小也存在差异，佐剂相同时，卵白蛋白剂量越大，蓝斑直径越大，且腹腔致敏途径蓝斑直径稍大于皮下致敏途径；致敏剂量、致敏途径相同时，氢氧化铝佐剂+卵白蛋白作为抗原的蓝斑直径大于弗氏完全佐剂+卵白蛋白作为抗原的蓝斑直径。

也有使用其他佐剂的研究。荆宝琴等[10]比较了3种佐剂引起SD大鼠PCA的反应程度，过敏发生率和反应严重程度依次为百白破联合疫苗＞百日咳菌液＞氢氧化铝。孙鸽等[11]研究表明，卵白蛋白+百白破疫苗作为致敏原，出现阳性结果的可重复性不高，且百白破联合疫苗、百日咳菌液费用较贵，购买困难，且有效期短，不适宜大规模试验。氢氧化铝和弗氏完全佐剂则可获得较稳定的阳性结果，重复性高，但这两种佐剂也都存在着不同优缺点。弗氏完全佐剂现可从Sigma等公司购买商品化成品，质量稳定，使用方便，但其价格较高，较黏稠，不利于注射，氢氧化铝佐剂价格便宜，购买方便，但其配制方法繁琐，对pH值范围要求较高。应用这两种佐剂时，无论是皮下还是腹腔致敏途径，都会在注射部位引起较严重的局部反应，由于佐剂的吸收速度慢，导致皮下注射后易形成肿块，腹腔途径致敏时，大鼠出现腹腔内肠黏膜炎性粘连[12]，体重增长缓慢。在本试验条件下，佐剂选用氢氧化铝佐剂和弗氏完全佐剂，卵白蛋白使用剂量为10 mg/只时，便能得到较好的蓝斑，因此，各实验室可根据受试物特性选择合适的佐剂，推荐大鼠被动皮肤过敏试验中阳性物质选择卵白蛋白，同时，我们也期待新型佐剂的出现。