桃仁膝康丸质量标准的提升研究*

李 洁，张 磊，张 虹

河南省洛阳正骨医院河南省骨科医院(洛阳 471002)

主题词 方剂 @桃仁膝康丸 质量控制

膝关节骨性关节炎(KOA)，又称为膝关节增生性关节炎或退行性膝关节炎，是一种慢性进展性骨关节疾病。KOA为骨关节病中的常见病、多发病和疑难病，其病程长易反复发作，有效治疗和预防膝关节骨性关节炎已成为重大的公共卫生问题。平乐正骨历经200余年的传承与发展，已成为系统的独具特色的骨伤科学派。药物疗法是平乐正骨主要的治疗方法之一，一向被历代医学家所重视，创制了不少有效的方剂，一直沿用至今。桃仁膝康丸处方来源于名老中医经验方，是平乐正骨的传统药物，制剂批号：豫药制字Z20120243(洛)，是由桃仁、红花、三七、当归、川芎、细辛、没药等十余味药材组成的复方制剂。该制剂具有活血止痛，祛风湿，补肝肾之功效，适用于骨关节病早期关节疼痛，屈伸不利，膝部关节疼痛，上下楼梯更甚，或久蹲不易站立等症，经多年临床实践表明，该复方制剂治疗膝关节骨性关节炎疗效显著，临床需求量较大。

医院制剂在保障人民健康、保证临床医疗科研需要、提高医院医疗服务水平、开发新药等方面发挥着重要的作用，医院制剂的质量受生产工艺、技术水平、设备条件、贮存方法等诸多因素的影响，制剂质量控制贯穿制剂生产的全过程和各个环节，医院制剂的质量控制与标准提升是医院制剂发展的重要内容。建立和完善医院制剂的质量标准，切实加强对制剂各生产环节质量的监督和管理，对于指导药品生产、保证药品用药安全有效等均有着十分重要的意义。桃仁膝康丸是我院医院制剂需求量较大的品种之一，临床疗效较好，临床需求量较大，原质量标准中只有三七、白芍两味药的定性鉴别研究，为更好、更有效地控制制剂质量，课题组开展了桃仁膝康丸质量标准的提升研究，在定性鉴别研究中，增加了对桃仁膝康丸中当归、川芎、细辛、防风、没药等药味的薄层色谱鉴别方法，在含量测定研究中，增加了采用HPLC法测定独活的指标性成分二氢欧山芹醇当归酸酯的含量，以期为该制剂质量标准的提升，提供理论依据和技术支持。

材料与方法

1 材 料

1.1 仪器： AB135-S型分析天平(梅特勒-托利多有限公司)、ZF-7型三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)、HH-S26s型数显恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)、KH-600DB型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)、Agilent 1100高效液相色谱仪、DAD检测器、色谱柱Agilent 1100 C18柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)、Agilent化学工作站。

1.2 药材与试剂: 阿魏酸对照品(批号：110773-201614)；二氢欧山芹醇当归酸酯对照品(批号：111583-201605)；细辛脂素对照品(批号：111889-201504)；当归对照药材(批号：120927-201617)；川芎对照药材(批号：120918-201612)；没药对照药材(批号：天然没药120967-201405)；细辛对照药材(批号：121204-201606)；防风对照药材(批号：120947-201409)甲醇、乙醇、正丁醇，正己烷、乙醚、石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯等试剂均为分析纯，乙腈为色谱纯。中性氧化铝(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160713)。薄层层析硅胶G(青岛海洋化工厂)。

2 方 法

2.1 薄层鉴别:当归、川芎薄层鉴别研究：取桃仁膝康丸(批号;20170921)3 g，研细为粉末状，加乙醚20 ml，冷浸0.5 h，时时振摇，滤过后，挥干乙醚，残渣加乙酸乙酯1 ml，使之溶解，作为样品溶液。取不含当归、川芎的阴性制剂3 g，照样品溶液制备方法，制得双阴性对照溶液。分别取当归、川芎对照药材粉末各1g，用同样的方法，制得对照药材溶液。另取阿魏酸对照品，加甲醇制成含量为1 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。依据《中华人民共和国药典》(2015年版)四部通则中薄层色谱鉴别法[1]，分别吸取上述五种溶液，各2μL,将其点样于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)：乙酸乙酯(8:3)，作为展开剂，展开，取出并晾干后，置紫外光灯(365 nm)下检视。见图1。

2.2 细辛的薄层色谱鉴别试验：取桃仁膝康丸(批号;20170921)3 g，研细为粉末状，加入甲醇15 ml，超声处理20 min，过滤，蒸干滤液，残渣加入1 ml甲醇，使之溶解，作为样品溶液。取细辛对照药材粉末，取样量为1 g，用同法制得细辛对照药材溶液。取不含细辛的阴性制剂3 g，采用相同方法，制得阴性对照样品溶液。另取细辛脂素对照品，加入甲醇，制成含量为1 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。依据《中华人民共和国药典》(2015年版)四部通则中薄层色谱鉴别法[1]，分别吸取上述四种溶液，各2μL，分别将其点于同一硅胶G薄层板上，展开剂及比例：石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5:1)，展开后，取出并晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，105 ℃加热，直至斑点的显色清晰。结果见图2。

注：1、2、3为桃仁膝康丸样品，4为当归对照药材，5为川芎对照药材，6为阿魏酸对照品，7为双阴性对照

注：1、2、3为桃仁膝康丸样品，4为对照药材，5为细辛脂素对照品，6为阴性对照

2.3 没药薄层色谱鉴别研究:取桃仁膝康丸(批号：20170921)3 g，研细为粉末状，照挥发油测定法(《中国药典》2015年版四部通则挥发法)加石油醚(60-90℃)2 ml，缓缓加热至沸，保持微沸约3 h，放冷，取石油醚溶液，作为样品溶液。取没药对照药材粉末2 g，用同样方法，制得没药对照药材溶液。另取不含没药的阴性制剂15 g，同法制得阴性对照溶液。依据《中华人民共和国药典》(2015年版)四部通则中薄层色谱鉴别法[1]，分别吸取上述三种溶液，各2μl，分别将其点在同一硅胶G薄层板上，展开剂及比例：环己烷：乙醚(4:1)，展开后，取出并晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，用热风吹至斑点清晰。结果见图3。

注：1、2、3为桃仁膝康丸样品，4为对照药材，5为阴性对照

图3 没药薄层色谱图

2.4 防风薄层色谱鉴别研究:取桃仁膝康丸(批号;20170921)3 g，研细为粉末状，加入甲醇溶液15 ml，振摇后，密塞，超声处理20 min后，静置，滤过，蒸干滤液，残渣用1 ml甲醇使之溶解，作为样品溶液。取防风对照药材粉末，取样量1 g，加入甲醇15 ml，用同样方法，制得对照药材溶液。取不含防风的阴性制剂2 g，用同样方法，制得阴性对照溶液。另取，升麻素苷对照品，制成含量为1 mg/ml溶液，作为对照品溶液。依据《中华人民共和国药典》(2015年版)四部通则中薄层色谱鉴别法[1]，分别吸取上述四种溶液，各2μL,分别将其点于同一硅胶G薄层板上，展开剂及比例为三氯甲烷-甲醇-冰醋酸(6:1:1)，展开后，取出并晾干，用10%硫酸乙醇溶液喷洒，挥干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果见图4。

注：1、2、3为桃仁膝康丸样品，4为对照药材，5为升麻素苷对照品，6为阴性对照

结 果

1 色谱条件色谱柱 Agilent 1100 C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.5%乙酸水溶液(46：52)；流速：1.0ml/min；检测波长：330 nm；进样量为20μL，理论塔板数以二氢欧山芹醇当归酸酯计，应不低于6000。

2 对照品溶液的制备方法 精密称定二氢欧芹醇当归酸酯对照品适量，加入甲醇溶液，制得含量为每1 ml含50μg的溶液。

3 供试品溶液的制备方法 取桃仁膝康丸(批号;20170921)，约2.0 g，研细为粉末状，精密称定后，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液20 ml，密塞处理，称定其重量，超声提取(功率250 W，频率40 kHz)30 min后，放至室温，再称定其重量，用甲醇溶液补足减失的重量，然后摇匀，过滤，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即可。

4 阴性供试品溶液的制备 按处方制成缺独活的阴性样品，按上述制备方法，制成缺独活的阴性供试品溶液。

5 专属性实验 精密吸取桃仁膝康丸供试品溶液、对照品溶液，以及阴性制剂样品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，按照以上色谱条件测定。阴性样品在二氢欧山芹醇当归酸酯的保留时间无干扰峰，方法专属性良好。

6 线性范围的考察 取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，制成每l ml含二氢欧山芹醇当归酸酯0.205 mg的溶液，分别精密吸取0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml、0.7 ml于1 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，分别精密吸取上述对照品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到二氢欧山芹醇当归酸酯的回归方程为Y=4248.1χ-10.571，γ=0.9998。结果表明，二氢欧山芹醇当归酸酯的进样量在0.420～3.010 μg范围内，线性关系良好。

7 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分别进样20 μL，按上述色谱条件测定峰面积。结果二氢欧山芹醇当归酸酯含量RSD为1.56% (n= 6) ，表明样品中二氢欧山芹醇当归酸酯的含量在24 h内基本稳定。

8 精密度试验 精密吸取对照品溶液(0.205 mg/ml)20 μL，注入色谱仪，连续进样5次，按上述色谱条件测定，结果以二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积计算，RSD为0.98% (n= 6) ，表明仪器精密度良好。

9 重复性试验 精密称取桃仁膝康丸(批号为20170921)6份，按上述供试品溶液制备方法，制得样品溶液，分别精密吸取样品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积计算，RSD为0.88% (n=6)，结果表明，该方法重复性良好。

10 加样回收率试验 取同一批号桃仁膝康丸样品(批号20171025)适量，已知含量(1.1462 mg/g)，精密称定，称取6份，分别加入二氢欧山芹醇当归酸酯对照品溶液(0.43 mg/ml)各2ml，按上述供试品溶液制备方法，制备样品溶液，注入液相色谱仪，依照以上色谱条件，测定，计算样品的加样回收率。见表1。

表1 桃仁膝康丸中二氢欧山芹醇当归酸酯加样回收率

11 样品含量测定 取3批样品(产品批号：20170821、20171025、20171127)，依照上述供试品溶液制备方法，制备样品溶液，分别精密吸取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品溶液、样品溶液，各20 μL，注入液相色谱仪，按以上色谱条件，测定，外标法计算，二氢欧山芹醇当归酸酯的平均含量为1.1253 mg/g。

讨 论

在定性鉴别研究中，没药的薄层色谱鉴别研究，课题组分别考察了乙醚和乙醇超声提取结果，发现用乙醇提取所得斑点较清晰，分离情况较好。在防风薄层色谱鉴别方法研究中，分别考察了不同的展开剂，以及不同展开剂比例的图谱情况，所考察的展开剂及比例有：三氯甲烷-甲醇(5:1)、乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:1)及三氯甲烷-甲醇-冰醋酸(6:1:1)，发现以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸(6:1:1)为展开剂时荧光斑点分离较好，较清晰。细辛的薄层色谱研究中，结果发现在与对照品斑点相应位置，供试品溶液和对照药材溶液斑点均比较模糊，可能与该处方细辛所占比例较小，该成分含量较低有关。课题组在二氢欧芹醇当归酸酯的含量测定研究中，分别考察了超声提取法、冷浸法、回流提取法三种提取方法，测定结果显示，超声提取方法样品含量较高，且方法简便易行；考察了提取溶剂甲醇溶液、95%乙醇溶液的提取效果，发现用甲醇溶液提取，二氢欧山芹醇当归酸酯的含量较高同时对溶剂用量、提取时间等因素进行了考察。由于中药饮片的产地、炮制，制剂生产及贮藏等诸多因素的影响，均会对成品的有效成分含量产生影响。制剂质量是制剂的生命所在，医院制剂的质量标准与质量控制，是保证制剂生产全过程，切实可行地达到成品质量内在一致的重要手段与方法，也是保证医院制剂临床疗效的重要前提和保障[2-5]。采用现代质量控制技术，对医院制剂质量标准的研究，制剂产品质量的升级，必然推进各个生产环节的升级，进而形成对制剂内在质量进行有效控制，保证产品质量稳定的良性循环[6-8]。

医院制剂生产是一项复杂的工程，包括制剂原料的预处理、提取、分离、纯化、浓缩、干燥、制成制剂等多道工序,每个工序中，有多种工艺参数需要控制,这些工艺参数，可直接影响着制剂产品的内在质量。长期以来，由于技术条件所限，医院制剂不断改进生产工艺参数，并逐步完善与提高制剂的质量标准，以逐步改善同品种不同批次间质量参数差异较大，以及内在质量均一性较差等突出问题。医院中药复方制剂的质量标准研究，应以中医药理论为指导，运用现代药物质量控制理论和方法，对制剂产品建立质量标准，并通过标准对其质量加以控制，质量标准研究与质量控制是保证医院制剂临床疗效稳定性的核心所在。医院制剂质量的好坏不但直接影响其预防与临床治疗的成效，而且密切关系到人民群众的健康与生命安全。只有对医院制剂进行现代质量控制，才能更好的保证医院制剂的质量，并真正实现制剂生产与使用的稳定、可控，安全与有效、为医院制剂的良性奠定坚实的基础。

随着现代医药学的进步和发展，新工艺、新剂型不断出现，加之民众对自身保健意识的增强，人们对于医疗保健的需求趋于多元化。传统中药剂型对于治疗疾病有非常重要的作用，但同时也存在给药剂量大、服用不方便、浪费原材料等诸多问题。对现有传统中药复方制剂进行二次开发，运用现代科学技术方法和原理，采用新技术、新工艺、新辅料、新设备开发新剂型，提高制剂水平，优化药物生产制备工艺，制定出科学、严谨、完善的质量标准，确保用药的安全、有效、经济合理，有着非常重要的意义。医院制剂以其处方特色、研制周期短、价格便宜、满足临床不同需要而日益被社会所接受。然而医院制剂存在质量控制的规范性、生产设备的先进性等方面的不足，使得医院制剂的质量越来越受到广泛的关注。许多医院有各自的临床特色和独特的医疗特色，实现其由传统的供应保证型向技术开发型转变，对于发挥医院制剂潜能最大化很有意义的工作[9-10]。

桃仁膝康丸是平乐正骨的传统药物，也是我院临床应用最为广泛、需求量较大的院内制剂之一，在治疗膝骨性关节炎方面疗效较好。随着医药新政策的普及与推广，应用现代技术手段，对医院传统制剂重新评价研究，使其由传统供应保障型向技术研发型转变，以充分发挥医院制剂潜能，进一步发挥医药结合之优势。本试验对平乐正骨传统制剂桃仁膝康丸的质量标准进行提升研究，对该制剂的质量控制和进一步研发提供理论依据和技术支持，对该制剂的进一步推广应用具有重要的意义和价值，为医院制剂由传统的供应保证型向技术开发型转变，提供一定的参考思路与方法。