托毒生肌凝胶对大鼠溃疡创面治疗的机制研究*

王瑞淑，左庆选，李新丽，彭金霞

1.河南省濮阳市人民医院创面治疗中心(濮阳457000)，2.湖北医药学院附属人民医院烧伤整形科(十堰442000)

主题词 溃疡 @托毒生肌凝胶 动物实验 大鼠

皮肤溃疡在临床上属于一种较常见的疾病，主要是由多种因素导致的体表皮肤溃烂或缺损，从而形成难愈的创面[1]。这种创面往往久治不愈，并在身体各处均能发生，给患者造成很大的痛苦。对其治疗的主要药物包括表皮细胞生长因子、前列腺素、碱性成纤维细胞生长因子等，但这些药物疗程较长，且费用昂贵，效果也不理想。随着中医药的发展，用中药治疗皮肤溃疡越来越受到大家的关注。郑琪[2]用四效散治疗慢性皮肤溃疡的治疗，10年治疗经验显示临床效果显著。李友山[3]的研究显示，中药辨证治疗明显降低瘢痕形成率，并促进创面的愈合，中药治疗慢性溃疡的疗效是确切的，但对其机制研究较少。由此本研究用托毒生肌凝胶用于大鼠溃疡创面进行治疗，以探讨其疗效及作用机制，为临床治疗提供依据。

材料与方法

1 材 料

1.1 动 物:SD大鼠(雄性，清洁级)，体重225～250 g，共56只(购自上海斯莱克公司)，饲养室温(22±3)℃、湿度(47±4)%，光照12 h明暗交替，自由饮水。使用许可证号为：SCXK(沪)2014-0002，动物合格证：SYXK(沪)2014-0005。

1.2 试 药:托毒生肌方组成：白芷、丹参、黄芪、紫草、血竭、大黄、珍珠粉、炉甘石等。重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶[批号20151220，规格：21000IU·(5g)-1/支)]卡波姆(批号20160122)，95%乙醇(批号20151122)；甘油(批号20160220)。总RNA提取试剂盒(批号R6852-01)；反转录试剂盒(批号RR415A)，实时荧光定量试剂盒(批号RR041Q，Takar公司)。

1.3 仪 器:实时荧光定量PCR分析仪(ABI7500)、普通PCR分析仪(ABI9700)，均由美国ABI公司提供；德国Eppendorf公司提供的核酸蛋白测定仪；美国普通PCR分析仪(ABI9700)。

1.4 药物制备:配方根据李友山[3]的处方，将黄芪、炉甘石、白芷各30.05 g，没药、丹参各15.05 g，血竭10.08 g，大黄15.13 g，珍珠粉30.10 g，紫草30.15 g均放到烧瓶中，倒入95%乙醇1500 ml，提取1 h；然后进行第2次95%乙醇(1000 ml)提取，时间1 h。把2次提取液充分混合，在静置过滤后浓缩到175 ml，随后取出12.5 ml继续浓缩至7 ml，并和溶胀好的卡波姆充分混合，制成提毒生肌凝胶(为使pH值达6～8，加三乙醇胺适量)。配置空白基质：取甘油0.5 g与卡波姆0.375 g，加水11.5 ml溶成空白凝胶基质，均在4 ℃下保存待用。

2 方 法

2.1 造模及分组:56只SD大鼠，在靠近头部的背部皮肤剪毛，脱毛(涂8%硫化钠，脱毛面积约3.5 cm×3.5 cm)，腹腔内麻醉[7%水合氯醛，剂量21(g/kg)],仰卧位在木板上固定消毒后，用直径2 cm图章做标记(在背部正中)，将全层皮肤、皮下的结蹄组织均剪掉，深达筋膜，制造全层皮肤开放性缺损创面，随机抽取42只用冰醋酸(50%)涂于创面，1次/d，连用7 d，制造大鼠溃疡创面模型。将造模成功大鼠随机分为三组(n=14)：模型对照组、贝复新组及托毒生肌组。剩余14只为对照组，各组大鼠从手术前1 d起，给予青霉素(4000U/只)后肢肌肉注射，连用4 d，分笼饲养，常规喂养。

2.2 用 药:对照组及模型对照组大鼠溃疡面涂抹适量空白凝胶；贝复新组大鼠溃疡面涂抹贝复新凝胶(重组碱性成纤维细胞生长因子凝胶)适量。托毒生肌组大鼠溃疡面涂抹托毒生肌凝胶适量，3组均1次/d，连用15 d。每组溃疡面用药后，上面覆盖医用纱布，胶带(医用)包扎。

2.3 观察指标及标本采集:创面恢复情况：A观察创面渗出水肿情况、有无分泌物、是否干燥与红肿等。B在造模后第3天、7天、15天时用标尺标记，并用数码照相机拍摄创面情况,以创面表现完全上皮化为愈合标准，观察不同时间点创面的愈合率，创面愈合率=(创面的原始面积-创面未愈合面积)/创面的原始面积×100%。C观察创面愈合时间：从造模至创面完全上皮化所用的时间。组织学检查：三组造模后治疗7 d、15 d时分别取创面中心的肉芽组织(各取7只)由病理医师做苏木精-伊红(HE)染色，用光镜对标本进行观察(随机5个视野)，用图像分析系统(Mias)3.0对图像进行分析，光镜下避开毛细血管观察肉芽组织成纤维细胞数(5个视野，取平均数)，同样方法每个标本观察3个视野，计算新生毛细血管数，取平均值。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)：取造模后用药7 d、15 d各组大鼠的创面组织100 mg进行裂解(加Trizol1mL),RT-PCR法对血管生成素-1(Ang-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、低氧诱导因子(HIF-1α)mRNA表达进行检测。使用内参均为β-actin。Ang-1上游引物为：5′GTGGAGAAGTCTATGTCCCT3′，下游引物为：5′GAGTGTTCAGCTTCTCCT3′;VEGF上游引物为：5′GTGGAGAGTGCTAGGTCCCT3′，下游引物为：5′CACTGAACTTCTGCTCTTTC3′;HIF-1α上游引物为：5′AGCTGTATTACTGTGCCTTTG3′，下游引物为：5′TATGGTTCTCGTGCCTTTGAT3′。

结 果

1 创面恢复情况 对照组炎性分泌物少，有新生上皮由外向中心生长，在15 d后大多创面已趋向愈合。模型对照组在治疗过程中，发现创面炎性分泌物较多，创面干燥结痂后，将痂取下，能够发现创面下有小空洞，有些皮肤发灰发白，新生上皮生长少量，愈合缓慢；贝复新组表现创面暗红色，干燥结痂，创面周围被新生上皮包围并向中心生长；托毒生肌组创面洁净湿润，创面基底部及周围均能见到鲜红肉芽组织，炎性分泌物较少，稀薄，呈淡黄色，有新生上皮(淡红色)从创面周围向中心生长。15 d后多数大鼠趋向愈合，有毛发覆盖。

2 各组创面组织形态 对照组成纤维细胞大量，有胞浆，核仁有着色，炎性细胞少；模型对照组表现新生毛细血管、成纤维细胞较少，但淋巴及中性粒细胞较多。贝复新组创面组织中成纤维细胞较多，不及托毒生肌组，有炎性细胞少数；托毒生肌组对照组成纤维细胞大量，有很多胞浆，核仁有着色，炎性细胞少(图1)。

图1 各组大鼠用药7d时创面组织形态变化(HE×400)

3 各组创面不同时间点愈合率分析 模型对照组、贝复新组各时间点愈合率明显低于对照组(F值=4.670、15.370、133.350，P=0.015、0.000、0.000)；托毒生肌组各时间愈合率明显高于模型对照组(t=2.965、5.503、15.441，P=0.006、0.000、0.000)，具体情况见表1。

表1 各组创面不同时间点愈合率分析(%)

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较，▲P<0.05。

4 各组创面愈合时间分析 贝复新组、模型对照组创面愈合时间明显高于对照组(F=19.000，P=0.000)；托毒生肌组创面愈合时间明显低于模型对照组及贝复新组(t=5.501、3.230，P=0.000、0.003)。见表2。

5 各组各时间点创面新生毛细血管及成纤维细胞数量对比 模型对照组各时间点新生毛细血管及成纤维细胞数目与对照组比较，差异有统计学意义(t=3.360、5.406、5.671、4.601，P<0.01)；托毒生肌组第7天、第15天新生毛细血管及成纤维细胞数目与模型对照组比较，差异均有统计学意义(t=3.540、4.939、5.397、4.540，P<0.01)。见表3。

表2 各组创面愈合时间分析(d)

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型对组比较情况，▲P<0.05

表3 各组创面新生毛细血管及成纤维细胞数量(个)

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较，▲P<0.05

6 各组各时间点创面Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表达 模型对照组、贝复新组各时间点大鼠创面组织中Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表达与对照组比较，差异有统计学意义(F=8.990、4.160、4.560、3.610、6.620、3.850，P=0.002、0.033、0.025、0.048、0.007、0.04)；托毒生肌组各时间点Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表达与模型对照组比较(t=6.203、4.215、3.626、3.773、4.819、4.922，P=0.000、0.000、0.001、0.001、0.000、0.000)。见表4。

表4 各组各时间点创面Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表达

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型对照组比较，▲P<0.05

讨 论

皮肤创面溃疡在中医学中属于“溃疡”范畴，近些年的研究表明[4]，中医药在治疗皮肤溃疡方面占有一定的优势。赵光明等[5]在研究中发现，回阳生肌膏对大鼠慢性溃疡创面的愈合有促进作用。本研究中使用的托毒生肌方，没药中含有大量挥发油成分，能经皮肤或呼吸道进入人体，发挥开窍、理气、调性功效，激发人体自身再生及调理功能，从而起到生肌、散瘀等功效。药理学研究显示[6]，没药有良好的镇痛、抗炎及收敛作用;炉甘石有收敛、祛湿、止痒等功能;血竭来自麒麟竭果实，由果实渗出的树脂经过加工而成，对生肌、散瘀与止痛作用显著，在临床上多用于疮疡不敛等。丹参可活血化瘀，与其他多药同用，发挥托毒生肌，收敛抗炎、活血祛瘀等功能[7]。除此之外，凝胶制剂更利于涂抹与吸收，发挥更好的生物相容作用。

本研究显示，托毒生肌组有较高的创面愈合率及较短的创面愈合时间，提示托毒生肌凝胶治疗溃疡创面的效果较好，此结果与徐杰男[8]的研究一致。Ang1主要经旁分泌的途径促进内皮细胞的迁移，其能够刺激血管，使血管渗透率明显增加，也可以使内皮细胞增加TGF-β的释放，并作用于FGF-4，使VEGF表达明显升高，从而使血管生成增加。VEGF为调控血管的新生的因子，能够促进血管内皮细胞的生成，刺激血管内皮细胞的增殖，发挥促进微血管新生的作用，另外，其能够使血管通透性增加，加速创面的愈合。程静[9]研究中指出，创面中VEGF如果持续保持分泌状态，对创面的愈合意义重大。洪立珠等[10]在研究中显示，其能够使毛细血管新生，改善微循环，并将创面代谢的毒物及产物带走。HIF-1α 属于一种多样性血管生成因子，研究证实，其能够使VEGF、Ang及PLGF等多种血管形成因子成为靶基因，从而加速创面的愈合，使血管新生数目增加。由此可知，Ang1/VEGF/HIF-1α 信号转导通路在血管新生、创面愈合中起着重要的促进作用。本研究结果显示，托毒生肌组用药7 d后，Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表达均明显升高，用药14 d后，这3种基因表达又明显降低，提示托毒生肌方用于溃疡创面效果优于贝复新，结果与病理学检查结果基本一致，与创面愈合分期也一致，其可能为托毒生肌凝胶治疗大鼠溃疡创面的作用机制。

综上所述，托毒生肌方用于溃疡创面模型大鼠的治疗，使创面愈合明显加快，其机制可能是通过调节Ang1/VEGF/HIF-1α 信号转导通路而发挥作用。