黄芪注射剂对糖尿病肾病小鼠肾脏脂联素表达影响的研究*

王 松，房 芳，鲁 冰，籍胤玺，付莉萍

河南省南阳市中心医院内分泌科(南阳 473009)

主题词 糖尿病肾病/中西医结合疗法 @黄芪注射剂 小鼠

糖尿病是常见的一种疾病，而糖尿病肾病是糖尿病的一种严重并发症，且发病率呈不断上升趋势[1]。糖尿病肾病病理特征主要为细胞外基质积聚、系膜增生、基底膜增厚及肾小球肥大等[2]。糖尿病肾病是造成终末期肾功能不全的一个主要病因，临床延缓以及治疗糖尿病肾病病程的进展较为困难[3-5]。中医学认为糖尿病肾病病机属本虚标实，随着中医药的不断深入研究，广泛应用于临床，且取得良好效果。黄芪是一种扶正补气中药，其成分主要为黄芪皂苷、黄芪多糖、黄芪黄酮等[6]。近年来研究报道显示黄芪注射液用于糖尿病肾病取得良好效果。脂联素是一种近年来新发现的脂肪因子，具有胰岛素增敏、抗动脉粥样硬化及抗炎作用等[7]。本研究旨在探讨黄芪注射剂对糖尿病肾病小鼠肾脏脂联素表达的影响，为本病研究提供参考。

材料与方法

1 材 料 SPF级C57BL/6小鼠80只，体质量(20±2)g，武汉大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCkx(闽)2011-0002。主要试剂：小鼠脂联素试剂盒(上海远慕生物科技有限公司)，PAS染色试剂盒(上海里奇生物科技有限公司)，链脲佐菌素(北京索莱宝科技有限公司)主要仪器：日本日立7600型全自动生化分析仪，美国强生血糖仪，日本Olympus光学显微镜。

2 方 法

2.1 造模方法：适应性喂养1周，给予高脂饲料喂养(胆酸盐1%、胆固醇2.5%、蔗糖20%、猪油10%、基础饲料66.5%)。于6周后一次性腹腔注射链脲佐菌素80 mg/kg诱发高血糖，实验前禁食12 h，链脲佐菌素应用前以0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成1%溶液。于1周后测定小鼠空腹血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L的继续喂养高脂饲料6周，在12周末选取造模组小鼠80只，二氧化碳窒息处死后取出肾脏，PAS染色，大部分PAS染色示小鼠肾小球肥大且基底膜增厚，以及系膜区膨胀则视为糖尿病肾病。

2.2 实验分组：80只小鼠随机分为空白组(n=16)、模型组(n=16)、阳性对照组(n=16)、低剂量实验组(n=16)、高剂量实验组(n=16)。

2.3 给药方法：空白组不给予造模，每日给予等剂量生理盐水灌胃；模型组于造模成功后给予等剂量生理盐水灌胃；阳性对照组给予坎地沙坦5 mg/(kg·d)灌胃；低剂量实验组给予1.0 mg/(kg·d)灌胃;高剂量实验组给予2.0 mg/(kg·d)灌胃,各组均持续8周，于8周末取肾脏组织，于-20℃下保存待测。

2.4 PCR检测肾脏组织脂联素mRNA表达：提取总RNA，采用酶标仪测定浓度，取适量总RNA，根据试剂盒说明书标准操作逆转录成cDNA，由生物工程有限公司合成引物。定量PCR采取荧光定量PCR染料法，β-actin内参引物和每个样本脂联素设置4个复孔，采用实时定量PCR仪分析PCR产物结果。

3 观察指标 观察各组体重和血糖变化；观察各组24 h尿量和24 h尿微量蛋白变化。采集24h尿量测定尿量，采用放射免疫分析法测定尿微量蛋白，尿微量蛋白试剂盒；观察各组肾功能指标变化，包括血肌酐和尿素氮，血肌酐试剂盒，尿素氮试剂盒。采用日立7600型全自动生化分析仪测定血肌酐和尿素氮；观察各组肾脏组织脂联素mRNA表达。

4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件处理数据，计量资料采用均数±标准差表示，计数资料采用例/%表示。对于两组组间计量资料采用独立样本t检验，对于多组计量资料采用F检验，计数资料采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组体重和血糖变化比较 模型组、阳性对照组、低剂量实验组和高剂量实验组体重无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，阳性对照组、低剂量实验组和高剂量实验组血糖降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，低剂量实验组血糖无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，而高剂量实验组血糖降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；高剂量实验组血糖低于低剂量实验组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组体重和血糖变化比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与低剂量实验组比较，□P<0.05

2 各组24 h尿量和24 h尿微量蛋白变化比较 与模型组比较，阳性对照组、低剂量实验组和高剂量实验组24 h尿量和24 h尿微量蛋白降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)。与阳性对照组比较，低剂量实验组24 h尿量和24 h尿微量蛋白无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，而高剂量实验组24 h尿量和24 h尿微量蛋白降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)。高剂量实验组24 h尿量和24 h尿微量蛋白低于低剂量实验组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组24 h尿量和24 h尿微量蛋白变化比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与低剂量实验组比较，□P<0.05

3 各组肾功能指标变化比较 与模型组比较，阳性对照组、低剂量实验组和高剂量实验组血肌酐和尿素氮降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，低剂量实验组血肌酐和尿素氮无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，而高剂量实验组血肌酐和尿素氮降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；高剂量实验组血肌酐和尿素氮低于低剂量实验组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组肾功能指标变化比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与低剂量实验组比较，□P<0.05

4 各组脂联素变化比较 与模型组比较，阳性对照组、低剂量实验组和高剂量实验组脂联素 mRNA表达降低(P<0.05)；与阳性对照组比较，低剂量实验组脂联素 mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，而高剂量实验组脂联素 mRNA表达降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)；高剂量实验组脂联素 mRNA表达低于低剂量实验组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组脂联素变化比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与低剂量实验组比较，□P<0.05

讨 论

流行病学调查显示，随着近年来人们饮食结构的不断变化、生活习惯的不断改变，使得糖尿病发病率呈逐年上升趋势，严重影响了人们生活质量和身心健康[8-9]。随着糖尿病发病率不断上升，使得糖尿病肾病发病率也呈不断上升趋势[10-13]。目前，临床上尚无有效的治疗糖尿病肾病方法[14-15]。中医学认为糖尿病肾病发病病机为脾失健运、湿热内蕴、津液不化，聚留为水，久病致水邪泛滥。消渴经久不愈，血运气血无力，则会血瘀阻络，阴虚、血瘀是贯穿糖尿病肾病病程的重要病机。黄芪注射液是一种纯中药制剂，现代药理研究表明，黄芪注射液具有抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫功能等多种生物活性，其成分中黄芪黄酮具有抗氧化清除自由基作用，认为其机理主要是酚羟基类基团在与过氧化物作用时，能够提供氢原子，从而发生氧化还原反应而发挥作用[16-17]。此外，黄芪注射液具有扩张肾血管、保护肾脏血管内皮功能、增加肾血流量及减少蛋白尿作用[18]。本研究表明，与模型组比较，阳性对照组、低剂量实验组和高剂量实验组24 h尿量和24 h尿微量蛋白降低，且高剂量实验组24 h尿量和24 h尿微量蛋白低于低剂量实验组，提示黄芪注射液可降低糖尿病肾病小鼠尿量和尿微量蛋白，且能够改善小鼠肾功能。

长期以来，多途径、多因素等相互作用被认为是糖尿病肾病的发病机制，但其具体机制尚未完全阐明，认为糖尿病时有多种途径造成炎症参与糖尿病肾病的发生、发展[19-20]。脂联素不仅与2型糖尿病、胰岛素、肥胖等相关，同时在免疫反应和炎症反应中发挥重要作用[21]。脂联素与胰岛素抵抗具有明显的相关性。目前，大部分学者认为胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷贯穿于2型糖尿病发生、发展的始终。而胰岛素抵抗、高胰岛素血症经多种途径会引起对肾脏组织损伤[22]。有研究报道显示，2型糖尿病患者脂联素水平明显上升，且随着糖尿病的进程不断发展，可能会导致更多的糖尿病肾病发生，且脂联素水平与糖尿病肾功能受损程度和病程成正相关[23]。由此可知，脂联素是脂肪组织分泌的具有抗氧化、抗炎、抗动脉硬化以及改善胰岛素抵抗作用，脂联素与心脑血管疾病、糖尿病、糖尿病肾病及肥胖等有相关性，故而认为脂联素可能是防治糖尿病肾病的一个新靶点[24-25]。本研究表明，与模型组比较，阳性对照组、低剂量实验组和高剂量实验组脂联素 mRNA表达降低，且高剂量实验组脂联素 mRNA表达低于低剂量实验组，提示黄芪注射液可降低肾脏脂联素表达。

综上所述，黄芪注射剂可降低糖尿病肾病小鼠肾脏脂联素表达，且可改善肾功能降低血糖，具有重要研究价值。但本文研究还存在一些不足，如纳入观察动物相对较少，还需在后续中增加观察动物，为进一步研究，提供可靠参考价值。