孜然超声波辅助提取及其抗氧化性研究

薛文君，商飞飞，豆海港

(1.周口职业技术学院，河南 周口 466001；2.贺州学院 食品科学与工程技术研究院，广西 贺州 542899)

孜然，学名CuminumcyminumL.，又名孜然芹、枯茗、香旱芹等，是伞形科(Umbelliferae)孜然芹属(CuminumL.)植物，作为一种极其重要的香辛料，其广泛应用于食品工业[1,2]。孜然籽中含有质量分数3%～5%的精油，成分主要有枯茗醛、桃金娘烯醛、α-萜品烯、β-蒎烯等[3]。孜然精油具有抑菌、杀虫、降血糖及防癌抗癌等生物活性功能。国内对孜然精油的功能研究主要集中在抑菌、杀虫等方面，国外则对孜然精油的药理作用做了比较系统的研究[4,5]。

超声波提取法的原理是超声波产生的机械作用，使液体内部产生强的冲击波和微射流，局部出现高温、高压，产生多重次级效应，从而加快体系的传质和传热速度，加速细胞内有效物质的释放、扩散和溶解[6]。由于超声波辅助提取具有提取率高、活性成分损失少等优点，目前已被广泛应用于动植物等天然原料中有效成分的提取[7,8]。本文以孜然为原料，采用超声波辅助溶剂提取法，在单因素试验的基础上，利用响应面中的Box-Behnken试验优化，同时对孜然提取物的抗氧化活性进行了初步研究，以期为孜然的开发利用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

孜然籽：购于当地超市，置于(80±1)℃干燥箱中干燥6 h，经粉碎后过筛，备用。试剂DPPH：购于美国Sigma公司；其他试剂：均为分析纯试剂。

1.2 主要仪器

XFB-500小型粉碎机、XD-52CS-1旋转蒸发仪、HH-6电热恒温水浴锅、KGD-1000S超声波发生器、FA2104电子分析天平、UV-754 型分光光度计。

2 方法

2.1 单因素试验

采用无水乙醇为提取剂，分别考察粉碎粒径(mm)、提取时间(h)、料液比(g/mL)对孜然提取物得率的影响。

2.2 响应面优化孜然提取试验

在单因素试验基础上，以粉碎粒径(X1)、提取时间(X2)、料液比(X3)3个因素为自变量，以孜然提取物得率为响应值，采用响应面Box-Behnken(BBD)中心组合设计，进行3因素3水平的优化试验，响应面分析因素和水平见表1。

表1 因素与水平编码表

2.3 抗氧化能力的测定

2.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定，参考游玉明等[9]的方法，分别取100 μL不同质量浓度的孜然提取物及对照溶液加入0.08 mg/mL的DPPH甲醇溶液100 μL，摇匀后于室温条件下避光静置30 min，在517 nm波长处测定光密度值。以DPPH溶液和甲醇溶液为空白，按照式(1)计算样品对DPPH自由基的清除能力。

(1)

2.3.2 ·OH清除能力的测定[10,11]

取l mL不同浓度的孜然提取物溶液于比色管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液l mL、6 mmol/L水杨酸乙醇溶液1 mL，加入8 mmol/L的H2O2反应，置于37 ℃水浴30 min后取出，在510 nm波长处测吸光度。以相同浓度维生素C为阳性对照，以蒸馏水做空白对照；重复试验3次，取平均值。

(2)

式中：A1为样品溶液+FeSO4溶液+水杨酸乙醇溶液+H2O2溶液的吸光度；A2为样品溶液+FeSO4溶液+水杨酸乙醇溶液+无水乙醇溶液的吸光度；A3为蒸馏水+FeSO4溶液+水杨酸乙醇溶液+H2O2溶液的吸光度。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 粉碎粒径对孜然提取物得率的影响

设定提取时间为1 h、料液比为1∶15 (g/mL)，分别在粉碎粒径0.6，0.45，0.3，0.2 mm条件下进行提取试验，以孜然提取物得率为指标，研究不同粉碎粒径对孜然提取物得率的影响，结果见图1。

图1 粉碎粒径对孜然提取物得率的影响

由图1可知，在相同的条件下，随着粉碎粒径的减少，孜然提取物得率先升高后缓慢减小，这可能是由于粒径的降低，促进物质的溶出，提高了得率，但当物料粒径达到一定大小时，再增加物料粒径可能使其表面能增加[12]，所以造成孜然提取物得率降低。当粉碎粒径为0.3 mm时，孜然提取物得率达到最大值。

3.1.2 提取时间对孜然提取物得率的影响

设定粉碎粒径为0.3 mm、料液比为1∶15 (g/mL)，分别在提取时间0.5，1.0，1.5，2.0 h下进行提取试验，以孜然提取物得率为指标，研究不同提取时间对孜然提取物得率的影响，结果见图2。

图2 提取时间对孜然提取物得率的影响

由图2可知，在相同的条件下，随着提取时间的延长，孜然提取物得率先升高后缓慢减低，当提取时间为1.5 h时，孜然提取物得率达到最大值。

3.1.3 料液比对孜然提取物得率的影响

设定粉碎粒径为0.3 mm、提取时间为1 h，按照料液比为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20 (g/mL)分别进行提取试验，以孜然提取物得率为指标，研究料液比对孜然提取物得率的影响，结果见图3。

图3 料液比对孜然提取物得率的影响

由图3可知，在相同的条件下，随着料液比的增大，孜然提取物得率先缓慢升高后减低，当料液比为1∶15 (g/mL)时，孜然提取物得率达到最大值。

3.2 响应面法试验

以孜然提取物得率为考核指标，对孜然超声波辅助提取的工艺条件进行优化，响应面试验设计及结果见表2。根据表2的有关数据，对孜然提取物得率进行统计分析，方差分析见表3。

表2 响应面试验结果

续 表

表3 方差分析

由表3可知，相关系数R2为93.35%，回归模型达到显著水平(Pr=0.012252<0.05)，说明回归模型的拟合度较好。通过SAS中RSRGE优化，可得出模型的回归方程为：

Y=4.513333-0.005X1-0.04875X2-0.08125X3-0.357917X12+0.26X1X2-0.075X1X3- 0.260417X22+0.1775X2X3-0.400417X32。

通过方程求解，可求出孜然提取物得率最优工艺组合：粉碎粒径为0.3 mm，提取时间为1.04 h，料液比为1∶12 (g/mL)。

为进一步分析双因素对模型的影响，将其中1个因素固定在零水平，研究另外2个因素对孜然提取物得率的影响，趋势图见图4。

图4 趋势图

图4中a表示将X3固定在零水平，由图4中a可以看出，响应值均随着X1和X2的增大先增大后减小；图4中b表示将X2固定在零水平，由图4中b可以看出，响应值随着X1的增大先增大后减小；由图4中c可以看出，响应值随着X2的增大先增大后减小，随着X3的增大先增大后减小。由图4分析可以得出，趋势图中有一稳定点且为最大值。

根据响应面法优化试验确定的工艺，对孜然提取物得率做了3次试验，进行验证，结果见表4。

表4 验证结果

由表4可知，验证试验结果与响应面优化试验结果相符合，说明响应面法优化孜然提取物工艺是合理的。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 DPPH自由基清除作用

DPPH是最古老的间接测定方法，广泛应用于测定天然抗氧化剂的自由基清除能力[13]，DPPH为稳定的自由基，溶于甲醇等极性溶剂中，DPPH自由基的清除是通过物质在反应中提供氢原子或电子来完成的。孜然提取物与BHT对DPPH自由基清除能力试验结果见图5。

图5 孜然提取物与BHT对DPPH自由基清除能力

由图5可知，随着浓度的增加，DPPH的清除率呈逐渐增大的变化趋势，孜然提取物对DPPH自由基清除率值都低于BHT，这种差异是由还原性物质的还原能力和浓度造成的，这些结构上的不同造成了抗氧化能力或其他生物活性的复杂变化。近来，研究表明孜然提取物[14]具有一定的自由基清除能力。

3.3.2 ·OH清除作用

孜然提取物与BHT对·OH清除能力试验结果见图6。

图6 孜然提取物与BHT对·OH清除能力

由图6可知，随着样品浓度增加，其对·OH的清除率也逐渐升高，当浓度达10 mg/mL时，孜然提取物对·OH的清除率最高，达75.6%。

4 结论

利用孜然超声波辅助提取工艺的优化研究表明，孜然提取物的最佳工艺条件为：粉碎粒径0.3 mm，提取时间1.04 h，料液比1∶12 (g/mL)，此时，孜然提取物的得率为4.51%。

孜然提取物对DPPH自由基及·OH抗氧化试验表明，孜然提取物在浓度2～10 mg/mL范围内，对DPPH自由基清除率及·OH清除率随着提取物浓度的增加呈现逐渐增大的变化趋势，浓度达10 mg/mL时，孜然提取物对·OH清除率为75.6%。