醋泡黑豆制备条件的优化

江帆，郭颖，李郢慧，杜双奎，王杏利，王华

(1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100； 2.西北农林科技大学图书馆，陕西 杨凌 712100； 3.渭南市食品执法监察支队，陕西 渭南 714000)

黑豆是我国珍稀的优异粮油作物资源，除含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素及异黄酮、强心苷等功能因子，还含有大量的抗氧化性物质[1,2]。陈醋具有抗疲劳、调节血糖、调节血脂、抗氧化等多种生理功能[3]。醋泡黑豆集合了黑豆和陈醋的营养和保健作用，据报道，醋泡黑豆具有美容、减肥、补肾、明目、乌发功能，可有效改善便秘、高血压、高血脂、腰酸腿痛、糖尿病、慢性疲劳、寒症、高胆固醇、冠心病等[4，5]。近年来，醋泡黑豆作为一种功能性保健食品已风靡日本。随着黑豆中的有效成分被不断地分离提取出来，其特有的功能性质引起了国内外研究者的广泛关注[6-8]。而民间醋泡黑豆大多属于作坊式生产，其制备条件和功能特性变化尚不明确。因此，优化醋泡黑豆的制备条件，开展其功能特性探究具有重要意义。本研究以黑豆和陈醋为试验材料，采用单因素试验、正交试验优化醋泡黑豆制备工艺条件，以期为醋泡黑豆产品的开发提供基础数据和指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

东北黑豆：购于辽宁省开原市钜富商贸有限公司；山西陈醋：总酸≥3.6 g/dL，购于山西来福老陈醋股份有限公司；没食子酸、芦丁、儿茶素：购于Sigma公司；福林-酚(Folin-Ciocalteu)试剂：购于上海喜润化学工业有限公司；1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)、其他试剂等：均为分析纯级。

1.2 主要仪器与设备

RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂； FW 100型高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；UV mini 1240单孔紫外分光光度计 日本岛津公司；HH-S4 A型恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；KDC-40 低速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑豆的预处理

将黑豆分选、清洗、沥干后为生黑豆样品。将生黑豆样品用水泡制过夜后煮制20 min，冷却至室温，沥干水分即为熟黑豆样品。

1.3.2 加醋浸泡

将准备好的生、熟黑豆样品放入玻璃罐中，分别按试验设计比例加陈醋泡制，玻璃罐密封后分别置于室温和0～4 ℃冰箱中，泡制2，5，7，14天后，分别取出醋泡黑豆样品进行分析。

1.3.3 样品处理

将泡制好的黑豆样品取出，在30 ℃干燥16 h，随后用高速粉碎机粉碎，过40目筛，收集筛下物，4 ℃保存备用分析。

1.3.4 试验设计

分别以黑豆与陈醋的比例、浸泡温度和浸泡天数为试验因素，设置不同的水平进行单因素试验。黑豆与陈醋的比例设置为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，浸泡温度为室温(24～27 ℃)和2～4 ℃；浸泡时间：熟黑豆设置为2，10，12，14，16天，生黑豆设置为5，7，9，11，13，15，17天。以总酚含量、总黄酮含量和DPPH·清除率为指标衡量抗氧化性。

在单因素试验的基础上，采用L16(42×29)设计正交试验，优化制备条件，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 分析测定

1.3.5.1 提取液的制备

称取2.00 g黑豆粉，用25 mL 70%丙酮25 ℃条件下在振荡器中振荡提取3 h，3800 r/min离心10 min，收集上清液。残留物用70%丙酮再提取3 h，离心，合并提取液，定容至50 mL，冷藏保存，备用。

1.3.5.2 总酚含量的测定

采用福林-酚(Folin-Ciocalteu)法测定[9]。

标准曲线制作：准确称取0.1 g没食子酸，用蒸馏水定容至100 mL，再吸取此溶液2 mL，定容至50 mL，使得溶液浓度为0.04 mg/mL。分别取没食子酸标准溶液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4 mL于一组10 mL容量瓶中，各加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，混合。随后各加入2.5 mL 20% Na2CO3混合，并用蒸馏水定容，室温避光静置2 h，测其在765 nm下的吸光度，以没食子酸浓度为横坐标，A765值为纵坐标绘制标准曲线。回归方程为y=0.0959x+0.0401(R2=0.9996)。总酚含量以每1 g提取物(干基)中所含相当于没食子酸的量表示。

样品测定：取1 mL样品提取液，按照上述步骤测定样品中总酚含量。每一试样重复测定3次。

1.3.5.3 总黄酮含量的测定

标准曲线制作：准确称取0.05 g芦丁标准品，用无水乙醇定容至50 mL，摇匀，再吸取此溶液10 mL于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，充分混匀，使得芦丁标准溶液的浓度为0.2 mg/mL，备用。分别吸取芦丁标准液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL于一组10 mL容量瓶中，加30%乙醇至5 mL，之后加入0.3 mL 5% NaNO2，摇匀，静置5 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，摇匀，静置6 min，然后加入4 mL 4% NaOH，用蒸馏水定容，摇匀并静置15 min，在510 nm下测定吸光值，以溶剂做空白，绘制吸光度与芦丁浓度的标准曲线。回归方程为y=12.582x+0.0007(R2=0.9994)。总黄酮含量以每1 g提取物(干基)中所含相当于芦丁的量表示。

样品测定：取1 mL样品提取液，按照上述步骤测定样品中总黄酮的含量。每一试样重复测定3次。

1.3.5.4 DPPH·清除率测定

取1.0 mL样品提取液，加入2 mL 2×10-4mol/L DPPH和4.0 mL无水乙醇，充分混合，室温下避光静置30 min，以无水乙醇做空白，于517 nm下测定吸光度。计算样品提取液对DPPH·的清除率：

式中：A0为用无水乙醇代替样品液时的吸光度；A1为加样品与DPPH时的吸光度；A2为用无水乙醇代替DPPH时的吸光度。

2 结果与分析

2.1 黑豆与陈醋的比例对醋泡黑豆品质的影响

以不同比例陈醋在2～4 ℃下浸泡熟黑豆8天，醋泡黑豆的总酚、总黄酮含量及DPPH·清除率测定结果见表2。

表2 黑豆与陈醋的比例对醋泡黑豆品质的影响Table 2 The effect of the ratio of black beans and mature vinegar on the quality of vinegar soaked black beans

由表2可知，黑豆与陈醋的比例对醋泡黑豆的抗氧化特性有影响。在黑豆与陈醋的比例为1∶3时，醋泡黑豆的总酚含量达到最大(2.174 mg/g)，总黄酮含量随着浸泡醋比例的增加呈先降低后升高的趋势，在黑豆与陈醋比为1∶4时含量最高(1.913 mg/g)。与未处理黑豆相比，醋泡黑豆的总酚含量、总黄酮含量有所降低。未经处理的生黑豆DPPH·清除率为64.27%，醋泡后清除效果显著提高，均在90%以上。

2.2 浸泡温度对醋泡黑豆品质的影响

以黑豆与陈醋的比例为1∶3，在室温为2～4 ℃下浸泡熟黑豆2天，其总酚、总黄酮含量及DPPH·清除率的测定结果见表3。

表3 浸泡温度对醋泡黑豆品质的影响Table 3 The effect of the soaking temperature on the quality of vinegar soaked black beans

由表3可知，在2～4 ℃下制备的醋泡黑豆的总酚和总黄酮含量明显高于室温处理。醋泡黑豆的总酚和总黄酮含量低于熟黑豆的总酚和总黄酮含量(2.89，2.31 mg/g)。2～4 ℃下制备的醋泡黑豆与室温的DPPH·清除率两者差异不大，但均高于原黑豆(82.03%)。

2.3 浸泡时间对醋泡黑豆品质的影响

当黑豆与陈醋的比例为1∶4、室温下浸泡黑豆时，醋泡黑豆的总酚、总黄酮含量及DPPH·清除率测定结果见表4。

表4 浸泡时间对醋泡黑豆品质的影响Table 4 The effect of the soaking time on the quality of vinegar soaked black beans

由表4可知，随着浸泡时间的延长，醋泡黑豆的总酚、总黄酮含量呈先升高后下降的趋势，总酚和总黄酮含量均在第9天达最大(2.726，2.311 mg/g)。这与黑豆浸泡初期浸吸陈醋导致总酚、总黄酮含量增大有关；当浸吸达到饱和后，黑豆皮中的总酚、总黄酮含量会随着浸泡时间的延长而溶出到陈醋中，从而导致抗氧化物质含量出现下降趋势。DPPH·清除率并未随着时间的延长而呈现规律变化，醋泡后黑豆的DPPH·清除效果显著提高，均高于原黑豆。

2.4 醋泡黑豆制备条件的优化

以总酚、总黄酮为试验指标，以浸泡时间、黑豆与陈醋比例、浸泡温度、黑豆生熟为试验因素，L16(42×29)正交试验方案及分析结果见表5。

表5 L16(42×29)正交试验方案及总酚、总黄酮测定结果Table 5 Orthogonal experimental scheme of L16(42×29) and test results of total phenols and total flavonoids

续 表

由表5极差分析可知，影响醋泡黑豆中总酚含量、总黄酮含量的因素主次顺序为D>C>A>B，即黑豆生熟影响最大，是主要因素，浸泡温度影响次之，浸泡时间、黑豆与醋的比例影响最小。进一步方差分析结果表明(见表6)，黑豆生熟对醋泡黑豆总酚含量、总黄酮含量的影响达到极显著(p=0.0004，p=0)，浸泡温度对总酚含量的影响显著(p=0.0184)，对总黄酮含量的影响极显著(p=0.005)，而浸泡时间、黑豆与陈醋的比例对总酚含量、总黄酮含量的影响均不显著(p>0.05)。从总酚角度分析，优化组合为A1B3C2D1，即以生黑豆为原料，按黑豆与陈醋的比例为1∶4在2～4 ℃下浸泡2天即可获得高总酚含量的醋泡黑豆；由总黄酮角度分析，优化组合为A2B3C2D1，即选取生黑豆为原料，按黑豆与陈醋比为1∶4在2～4 ℃条件下浸泡7天，醋泡黑豆具有高总黄酮含量。

表6 方差分析结果Table 6 Results of variance analysis

对生黑豆、熟黑豆、正交试验16个组合的醋泡黑豆DPPH·清除作用进行比较，见图1。

图1 不同条件下醋豆的DPPH·清除作用Fig.1 DPPH· scavenging activities of vinegar soaked black beans under different conditions

经陈醋浸泡过的黑豆，其DPPH·清除率均明显提高，与原始黑豆相比，清除率由原来的64.27%，78.56%增加到88%以上。表明陈醋浸泡过的黑豆，其抗氧化特性明显增强。

依据醋泡黑豆总酚含量分析，优化泡制条件为以生黑豆为原料，按黑豆与陈醋为1∶4在2～4 ℃条件下浸泡2天。总酚的保留率达到83.89%，总酚含量比生黑豆降低了16.11%；依据总黄酮含量分析，优化浸泡条件为以生黑豆为原料，按黑豆与陈醋比为1∶4在2～4 ℃条件下浸泡7天。总黄酮含量比生黑豆降低了5.18%，这与陈芬等人报道的醋浸能导致大豆总黄酮含量降低的结果相一致[10]。这可能与在陈醋浸泡过程中总黄酮水解，部分溶解在醋液中有关。综合考虑，浸泡2天的生黑豆中依然含有相对较高的抗营养因子，故确定生黑豆与陈醋按1∶4混合在2～4 ℃下浸泡7天为适宜浸泡条件。此时总酚含量为6.568 mg/g，总黄酮含量为6.619 mg/g。总酚、总黄酮相比原黑豆降低了16.77%，5.18%，依然有较高的保留率(83.23%，94.82%)。

3 结论

醋泡黑豆制备条件对醋泡黑豆的抗氧化特性有显著影响。黑豆生熟、浸泡温度对醋泡黑豆总酚、总黄酮含量的影响显著或极显著，浸泡时间、黑豆与陈醋的比例的影响不显著。优化制备条件为生黑豆与陈醋按1∶4混合在2～4 ℃下浸泡7天，总酚含量为6.568 mg/g，总黄酮含量为6.619 mg/g，具有较高的抗氧化特性。