紫果百香果外果皮中花青素的提取工艺及稳定性研究

胡 敏，欧阳军，胡 蓉，杜华英，罗秋水，熊建华*

(1.江西农业大学 食品科学与工程学院，江西 南昌 330045；2.江西省安远县果然食品有限公司，江西 安远 342100)

色素赋予食品缤纷的色泽韵味，给人以美的享受和味道的联想，现代食品工业使用的色素基本上都是合成色素，合成色素主要以煤焦油中分离的苯胺为原料加工制成，有不同程度的危害作用，情况严重可致癌、致畸、致突变，因此天然色素的获取和使用越来越受到人们的关注[1-2]。

花青素(anthocyanidin),又称花色素，是一种天然的水溶性色素，具有抗氧化，抗突变，抗肿瘤，抗疲劳，治疗心脑血管疾病等多种生理作用[3-4]。天然花青素虽在甘薯、葡萄、蓝莓、茄子等食物中广泛存在，但由于含量较低且食物价格较高等原因，至今在我国开发利用的相对较少，不能满足市场的需求[5]。百香果(PassifloraeduliaSims)，又名鸡蛋果，在气候温暖的海南、广西、江西赣州等地区具有较好的适应性[6-8]，产量正在逐年提高，百香果的消费主要以鲜果和果汁形式，产地及果汁加工厂有大量百香果果皮废弃物，百香果外果皮富含花青素[9]，本试验以紫果百香果为原料研究其外果皮中花青素的提取工艺及稳定性，为百香果资源的开发利用和天然花青素的获取、应用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器

试验材料：百香果紫香一号，江西果然食品有限公司提供。选择成熟、色泽紫红的百香果果皮，洗净晾干，剔除内果皮得到坚硬的外果皮，冷冻干燥，打成粉，过40目筛，干燥器中保藏，备用。

主要试剂：无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、山梨酸、苯甲酸钠等均为国产分析纯。

主要仪器：紫外-可见分光光度计(SPECORD 200)，旋转蒸发仪(RE-3000)，德国耶拿分析仪器股份公司；恒温水浴锅(HH-4)，国华电器有限公司；冷冻干燥机(FD-1D-50)，北京博医康实验仪器有限公司；超低温冰箱(902-ULTS)，美国赛默飞。

1.2 试验方法

1.2.1 百香果外果皮中花青素的提取及测定 称取1 g百香果外果皮粉末样品，加入一定料液比的乙醇溶液，回流提取一定时间，过滤，旋转蒸发，取一定浓缩液，用缓冲溶液稀释后测定吸光度A[10]，根据公式(1)、(2)计算花青素的提取率。

溶液花色苷含量(mg/L)=A×MW×DF×1000/ε×1

(1)

花色苷提取率(mg/g)=C×V/m

(2)

式(1)中，A为吸光度；MW为花色苷相对分子质量(465)；DF为稀释倍数；ε为摩尔消光系数(35 481)；1为比色皿光程(1 cm)，以 3′甲花翠素-3-葡萄糖苷计；式(2)中，C为溶液花色苷质量浓度(mg/mL)，V为溶液体积(mL)；m表示百香果果壳质量(g)。

1.2.2 单因素试验 选择单因素试验因素及水平范围为pH 1～6，料液比1∶15～1∶40，提取时间1～6 h，提取温度10～60 ℃和乙醇浓度40%～90%。探究百香果外果皮中花青素的最佳单因素提取条件。

1.2.3 提取工艺响应面优化 根据Box-Behnken试验设计原理，采用4因素3水平的响应面分析方法[11]，优化百香果外果皮花青素的提取工艺。根据单因素的结果分析，选择提取pH为2，以料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度为响应变量因子，以A、B、C、D表示。试验因素和水平编码设计见表1。

表1 响应面分析因子及水平表

1.2.4 花青素稳定性研究 将花青素提取液置于不同光线、不同温度、不同pH环境中，或添加氧化剂、还原剂、防腐剂、漂白剂、护色剂、不同离子进行稳定性测定，每隔一定时间测其吸收光谱，观察吸收度和最大吸收波长的变化，每组试验重复3次并与相应的空白进行比较对照。所有添加剂的卫生标准与添加剂量均符合国家标准。

2 结果与分析

2.1 单因素对百香果外果皮花青素提取效果的影响结果

由图1a可知，花青素在510～530 nm波长范围内均有吸收，且提取效果受pH的影响较大，当样品提取液pH为1、2时，花青素吸光度较强，提取效果较好，pH为3、4、5时，色素溶液吸光度降低较多，提取效果降低，在扣除基线的影响下，pH=1时，提取花青素效果最好，提取率为2.881 mg/g，但pH=1的酸性太强，花青素天然结构受到一定程度的破坏，pH=2时，提取率为2.877 mg/g，两者提取效果相差不大，结合实际情况选择pH=2为最佳提取酸度。由图1b可知，当乙醇浓度为80%～90%时，百香果果壳花青素提取率基本稳定。由图1c可知，在一定范围内，随着温度的升高，花青素提取率不断增大，当温度超过30 ℃时，提取率随温度的升高反而呈下降趋势，可能因为温度过高会使花青素的稳定性受到影响，结构改变所致，因此最佳提取温度为30 ℃左右。由图1d可知，在一定的条件下，随着时间增加，百香果外果皮花青素提取率随之增加，当时间为4 h时，提取率到达最大，之后提取率降低，可能是由于长时间加热使色素氧化所致，因此选取4 h为最佳提取时间。由图1e可知，随着料液比的增加，百香果外果皮中物质在溶剂中溶解量增加，提取率不断增大，当料液比达到1∶25时，溶质在溶剂的溶解达到饱和[12]，提取率达到最大值2.985 mg/g，因此最佳料液比1∶25。

图1 pH、乙醇浓度、温度、时间、料液比对百香果外果皮花青素的提取率的影响Fig.1 Effects of pH,ethanol concentration,temperature,time,and solid-to-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanidin in passion fruit outer skin

2.2 响应面试验分析

按照单因素试验，选择提取pH为2，采取4因素3水平响应面设计，以料液比Z1=(A-25)/5，提取温度Z2=(B-30)/10，提取时间Z3=(C-4)/1，乙醇浓度Z4=(D-80)/10为自变量，以百香果外果皮中花青素提取率Y为响应值，对提取花青素的工艺进行优化。试验方案及结果如表2。

采用Design Expert 8.0.6软件对百香果外果皮中色素提取的试验数据进行响应面回归分析，得到拟合方程：Y=3.05+0.043Z1+0.081Z2-0.031Z3+0.060Z4+0.050Z1Z2-0.13Z1Z3+ 0.030Z1Z4-0.094Z2Z3+0.020Z2Z4+0.040Z3Z4-0.20Z12-0.16Z22-0.18Z32-0.15Z42。回归方差分析见表3。

表2 试验方案及结果

由表3分析可知，该回归方程的一次项和二次项影响极显著，表明该模型不是简单的线性关系，是二次抛物线的关系[13]，交互项Z2Z4不显著，说明两者之间相互影响不大，其余交互项显著或极显著，表明相互之间影响极大。各因素对花青素提取效果影响的显著性与花青素易氧化的优越抗氧化性能相吻合，由F值可知，影响百香果外果皮花素提取率由大到小的顺序依次是提取温度、乙醇浓度、料液比和提取时间。

整体模型P<0.01，表明该二次方程模型极显著。R2为0.991 2，说明该模型响应值的变化99.12%来自所选因变量，因此，该试验方法能较好地反应试验结果的可行性，失拟项P>0.05不显著，说明该模型拟合性好，可对最佳提取条件进行预测。根据Box-Behnken软件分析得到百香果外果皮花青素最佳提取条件：料液比1∶26.28，温度33.84 ℃，时间3.74 h，乙醇浓度82.18%。考虑到试验操作条件更可行，将花青素最佳工艺调整为：料液比1∶26，提取温度34 ℃，提取时间3.8 h，乙醇浓度82%。

响应值对各单因素所组成的三维图，即为响应面图，按照二次回归方程，作出响应面曲面图和等高图(图2A～F)，等高线形状反映出交互作用的显著差异性。图2E等高线几乎接近圆形，表明温度与乙醇浓度交互作用不显著，图2A～D、图2F等高线图形为椭圆形，表明相互之间交互作用显著，与表3结果相符。

表3 回归分析结果

A:(料液比和温度)响应面图和等高图 A:Interaction and solid-liquid ratio and temperature response surface and contour map

B:(料液比和时间)响应面图和等高图B:The material liquid ratio and time interaction response surface and contour map

C:(料液比和乙醇浓度)响应面图和等高图C:The material liquid ratio and ethanol concentration interaction response surface and contour map

D:(温度和时间)响应面图和等高图D:Temperature and time interaction response surface and contour map

E:(温度和乙醇浓度)响应面图和等高线图E:The response surface temperature and ethanol concentration interaction diagram and contour map

F:(时间和乙醇浓度)响应面图和等高线图F:Time and ethanol concentration interaction response surface and contour map图2 各两因素交互影响的响应面图和等高线图Fig.2 Response surfaces and contour plots showing the interactive effects of solid-liquid ratio，temperature,ethanol concentration and time on the anthocyanin extraction rate from passion fruit

2.3 百香果外果皮中花青素最佳提取工艺的确定和验证

在选定的优化条件下，对花青素的提取进行验证试验，结果如表4，花青素实际提取率为3.125 mg/g，与预测提取率3.080 mg/g相对误差仅为1.402%，因此，该提取工艺稳定，可用于实际操作。

表4 验证实验结果(n=3)

2.4 稳定性影响结果

2.4.1 光照对花青素稳定性影响分析 由下列图3a、图3b、图3c可知，不同的光照对花青素影响不同，室内和避光时影响较小，吸光度随着光照天数增加略微下降，在室外(11月份)太阳光下花青素吸光度下降较快，第6天吸光度下降了15%，第12天时下降了91%，吸收峰基本消失。所以太阳光对花青素稳定性影响很大，保存时应尽量避免强光的直射。

图3 不同环境对花青素稳定性的影响Fig.3 Effects of different environments on the stability of anthocyanins

2.4.2 温度对花青素稳定性影响分析 由图3d、表5可知，在50～100 ℃的范围内，随着温度升高，花青素的最大吸光度下降的速度越快，至200 ℃时吸光度大幅度下降，最大吸收波长甚至产生红移，所以色素在高温条件下稳定性较差，结构可能产生改变，使用该色素应该避免高温加热工艺和高温储藏。

2.4.3 氧化剂和还原剂对花青素稳定性的影响分析 由图4、5，表6可知，加入Vc后体系的吸光度降低，而且随着放置时间的延长，吸光度降低的越多；体系随浓度的增加，吸光度值下降越快，浓度为0.2%时，Vc的吸光度降低了19%左右，浓度为1.0%时，吸光度降低了23%左右，浓度为2.0%时，吸光度降低了25%左右。H2O2对花青素的消色效果相较Vc更大，最终最大吸收峰会消失，且H2O2的浓度越大，吸收峰消失时间就越短，0.2%H2O2吸收峰消失耗时6 h，1.0%H2O2吸收峰消失耗时3 h，2.0%H2O2吸收峰消失耗时2 h。因此，储存和使用花青素时，应该尽量避免接触还原剂或氧化剂，尤其是氧化剂。

表5 温度对花青素稳定性的影响

图4 Vc对花青素稳定性的影响Fig.4 Effect of Vc on the stability of anthocyanin

图5 H2O2 浓度对花青素稳定性的影响Fig.5 Effect of H2O2 on the stability of anthocyanin

时间/h TimeVc0.2%1.0%2.0%H2O20.2%1.0%2.0%00.624 70.624 70.624 70.624 70.624 70.624 710.484 60.513 20.521 90.385 00.167 70.261 020.505 70.500 90.511 50.298 40.265 80.261 830.505 70.478 80.466 60.231 10.258 10.256 4

2.4.4 防腐剂对花青素的稳定性影响分析 由图6可知，山梨酸钾和苯甲酸钠对花青素的影响很小，即使是用不同浓度的山梨酸钾和苯甲酸钠对色素溶液也几乎是无任何影响。

图6 防腐剂对花青素稳定性的影响Fig.6 Effects of preservatives on the stability of anthocyanins

图7 漂白剂对花青素稳定性的影响Fig.7 Effect of bleaching agents on the stability of anthocyanins

2.4.5 漂白剂对花青素的稳定性影响分析 由图7可知，NaHSO3对花青素溶液有减色效应。减色效果是随NaHSO3的浓度增加而越明显，加入0.1%NaHSO3后，吸光度的波峰已经消失，故花青素溶液应避免与漂白剂NaHSO3接触。

2.4.6 发色剂对花青素稳定性影响分析 由图8可知，NaNO2对色素溶液有减色效应，减色效果由大到小依次为：0.50% NaNO2、0.25% NaNO2、0.10% NaNO2和0.05% NaNO2，色素溶液中加入NaNO2后，溶液的最大吸收波长消失。色素浓液的颜色也逐渐由鲜红色慢慢转变为无色浓液，所以NaNO2对色素溶液影响很大，要避免色素溶液和NO2-接触。

2.4.7 pH对花青素的稳定性影响分析 将提取的花青素溶液至不同pH并扫描其吸光度，由图9可以看出，花青素溶液稳定性随pH值的变化趋势与提取时一致，由于花青素结构发生变化，随pH值增大吸光度下降，并且在酸性环境中呈亮红色，pH接近5时，渐有蓝色掺入，最大吸光波长红移，因此，花青素比较适用于酸性食品中。

图8 发色剂对花青素稳定性的影响Fig.8 Effect of color fixative on pigment stability

图9 pH对花青素稳定性的影响Fig.9 Effect of pH on the stability of anthocyanin

2.4.8 不同金属离子对花青素的稳定性影响分析 由表7可以看出，Al3 +、Fe3 +、Fe2+、Cu2 +对花青素溶液有增色效果，其中Al3 +的增色效果最为明显；Fe3 +增色效果其次，随着Fe3 +浓度的增加，吸光度增加，但最后花青素溶液会因为高浓度Fe3 +产生沉淀；再次是Fe2+、Cu2+浓度较低时增色效果不明显，浓度较大时，对花青素的溶液有增色作用； 不同浓度Ca2 +、Mg2 +、Na+、K+对花青素溶液的稳定性基本无影响，故该花青素溶液应该避免与铁制品、铝制品、铜制品接触。

表7 不同金属离子对花青素稳定性的影响

3 结 论

本试验以紫果百香果外果皮为原料，乙醇溶液为提取剂，通过采用单因素初筛和Box-Behnken优化试验，得出回归方程：Y=3.05+0.043Z1+0.081Z2-0.031Z3+0.060Z4+0.050Z1Z2-0.13Z1Z3+0.030Z1Z4-0.094Z2Z3+0.020Z2Z4+0.040Z3Z4-0.20Z12-0.16Z22-0.18Z32-0.15Z42，一次项和二次项影响极显著，交互项Z2Z4不显著，其余显著，说明该方程为二次抛物线。pH=2，料液比1∶26，温度34 ℃，时间3.8 h和乙醇浓度82%为最佳提取条件。

百香果外果皮花青素的耐强光和高温能力较差，200 ℃时最大吸收波长甚至产生红移现象；NaHSO3、NaNO2、还原剂Vc和氧化剂H2O2对色素溶液有消色作用，NaHSO3、NaNO2能使色素溶液完全消色，还原剂Vc和氧化剂H2O2使色素溶液部分消色；Al3 +、Fe3 +、Fe2+、Cu2 +对色素有增色作用，Al3 +增色作用最强，而Fe3 +其次，高浓度时甚至产生沉淀现象，Fe2+再次，Cu2 +只有浓度较大时才会有较明显的增色作用，金属离子Na+、K+、Mg2 +、Ca2 +对花青素影响不大；pH值对花青素影响较大，pH在1、2、3、4的花青素溶液是呈鲜亮的红色，pH接近5时，色素溶液开始由亮红渐变为蓝绿色；不同浓度的防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠对色素溶液几乎是无任何影响。研究结果表明，天然百香果花青素稳定性较差，可受到较多因素的影响，作为着色剂应用到食品、医药及保健品等产品中应注意使用和保存条件。