UPLC双波长法同时测定水产品中7种麻醉剂的含量

禤开智，陈艺玮，纪少凡

(海南出入境检验检疫局技术中心，海南 海口 570311)

水产品是大自然赋予人类的美味佳品，特别是食用鱼类由于其蛋白质含量丰富，脂肪含量较低，营养价值极高，且味道鲜美，一直是现代人们餐桌上必不可少的美食。伴随着生活水平的不断提高，人们对于食用鱼的新鲜程度和产品质量都有了更高的要求，因此在长途运输和保存过程中如何保证食用鱼的品质就成了大家最为关注的问题。

在长途运输过程中，各种不确定的环境或人为不利因素均可能导致鲜活水产品产生应激反应，会引起肉质出现不同程度的损伤，甚至会导致水产品的直接死亡，使其口感变差，价值大幅降低。相关研究表明，改善水产品的生存环境，通过物理或化学手段来降低其体内新陈代谢活动，可以有效延长水产品的存活时间，大幅提高水产品价值。麻醉剂因有良好的镇静作用，在运输过程中可以有效降低水产品的新陈代谢，减少机体损伤，因而人们很早就将各类麻醉剂引入鲜活水产品运输中，从而大大提高了水产品在运输过程中的存活率。目前，有报道的各国应用于水产品保活的麻醉剂种类很多，如：MS-222、苯佐卡因、利多卡因、普鲁卡因、丁香酚、乙醚等。这些起效快、成本低的麻醉剂虽能达到提高运输成活率目的，但其对应的残留安全性问题亦不容忽视。各国及国际组织在结合药物安全性评估研究基础上，对于鱼用麻醉剂的使用管理上各有差异。日本规定了水产品中丁香酚的残留限量为0.05 mg/kg，美国和加拿大则禁止使用丁香酚作为鱼用麻醉剂，欧盟和澳大利亚对水产品中苯佐卡因的使用制定了限量。美国FDA规定所有经过MS-222麻醉的鱼类必须经过21 d的药物消退期才可上市出售，还发布了不当使用苯佐卡因可能引起人体高铁血红蛋白血症的警示信息。但我国目前针对此类鱼用药物的安全性相关法规、研究和管理信息尚存空缺，GB 2760和GB 2762最新版均未明确规定其在食品中的最大残留限量。为切实保障人们身体健康与生态环境，规范有序水产行业的健康发展出发，提高大众对食品安全的认知，及早对该类药物的使用安全性及检测分析显得异常重要，其可有利于引导规范用药，提升政府安全监管水平。

目前，国内针对鱼用麻醉剂的研究多为对其药用制品中的含量、应用于鱼类中的麻醉效果、作用机制、方法应用和对血液成分的分析研究，零星文献限于水产品中单一麻醉剂的检测，但能开发运用液相色谱同时对水产品中多类麻醉剂进行快速分析检测的研究尚未有报道。为此，本文在检测对象上选取传统鱼用麻醉剂和新类型麻醉剂相结合的方式建立了超高效液相色谱同时检测鱼肉中苯佐卡因、利多卡因、普莫卡因、普鲁卡因、丁香酚、丁卡因和布他卡因7种麻醉剂残留量的方法，其具有推广性强、检测灵敏度足够、分析速度快等优点。能为我国后续的食用水产品的麻醉剂质量安全监管提供一种准确、快速、简便的检测参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼、金鲳鱼和鳗鱼(购自海口市、临高县、文昌市某水产市场)：取肌肉可食部分进行高速均质制样，置于-18 ℃下保存备用，检测时提前自然解冻至室温；苯佐卡因标准品(benzocaine,CAS号：94-09-7，纯度98%，德国DR.公司)、利多卡因标准品(lidocaine,CAS号：137-58-8，纯度99.5%，德国DR.公司)、普莫卡因标准品(pramoxine,CAS号：637-58-1，纯度99%，美国sigma公司)、普鲁卡因标准品(procaine,CAS号：51-05-8，纯度99.5%，德国DR.公司)、丁香酚标准品(eugenol,CAS号：97-53-0，纯度99.5%，德国DR.公司)、丁卡因标准品(tetracaine,CAS号：94-24-6，纯度99.8%，德国DR.公司)、布他卡因标准品(butacaine,CAS号：149-15-5，纯度100%，美国USP公司)；甲醇、乙腈、正己烷：色谱纯，TEDIA公司；HLB固相萃取小柱(150 mg/6 mL，WATERS公司)：使用前依次以5 mL甲醇、5 mL水活化，保持柱体湿润；无水硫酸镁、氯化钠；磷酸：分析纯；5%甲醇水：量取5 mL甲醇，加水定容至100 mL；实验用水：超纯水。

标准储备液配制：分别准确称取7种标准品用甲醇溶解于棕色容量瓶中，配制成质量浓度为500 μg/mL的标准储备液，0～4 ℃避光保存。

混合标准中间液配制：分别移取适量的单标溶液于同一容量瓶中，用甲醇配制成5 μg/mL的混合标准中间液，0～4 ℃避光保存。临用时用流动相配成不同浓度的标准工作溶液。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪(UPLC)，配有紫外检测器，美国WATERS公司；MS3漩涡混合器，德国IKA公司；320R快速离心机，德国UNIVERSAL公司；2 500旋转蒸发仪，德国海道夫公司。

1.3 实验方法

1.3.1 提取 称取5 g试样(精确至0.01 g)，置于50 mL具塞离心管中，加入3 mL水和15 mL乙腈涡旋提取5 min，再加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁，涡旋震荡2 min，而后以9 000 r/min离心3 min，吸取上层乙腈提取液转至另一50 mL离心管中。

1.3.2 净化 提取液中加入10 mL正己烷，涡旋1 min，以9 000 r/min离心3 min，弃去上层正己烷，将下层乙腈置于氮气吹干仪中，40 ℃浓缩至大约1 mL，加入7 mL纯水稀释混匀，以小于1 mL/min的流速过已活化好的HLB柱，待样液完全流出后，用5 mL 5%甲醇水淋洗柱体，弃去全部流出液，抽干，以5 mL甲醇洗脱，将收集的洗脱液于40 ℃下旋转蒸发至近干，加流动相定容到1 mL，过0.22 μm水性滤膜，供液相色谱测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：waters acquity C18SB柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱温：40 ℃；流动相：乙腈:0.05%磷酸水(25:75)；流速：0.4 mL/min；进样量：10 μL；检测器：紫外检测器；检测波长：200 nm和290 nm。

2 结果与讨论

2.1 样品基质的选择

本方法选取的罗非鱼、金鲳鱼、鳗鱼均为当地市场消费量、出口量及养殖规模占比大的代表性品种。且罗非鱼为淡水养殖和脂肪含量低，鳗鱼的脂肪量相对较高，金鲳鱼为海水养殖品种。因此检测基质能满足通用性、多样性和复杂性的要求。

2.2 前处理提取条件的选择

7种药物均易溶于有机溶剂，但苯佐卡因和丁香酚不易溶于水。故本方法选取了乙腈、甲醇和乙酸乙酯3种实验室常规易获取的有机试剂作为提取液来比较提取效果。经过试验，乙酸乙酯提取率不及前两者，且对脂类物质的提取过多易形成乳化现象，影响后续的浓缩和净化步骤；乙腈和甲醇的提取回收都较好，但用乙腈提取对动物性基体具有沉淀蛋白效果，可减少杂质进入提取液的优点，有利于后续净化的简化以缩短检测耗时。因而确定乙腈作为提取剂，提取的同时借鉴QuEChERS技术，加入氯化钠和硫酸镁来改善提取净化效果，提高前处理效率减少后续的浓缩乙腈提取液的时间。

表1 不同柱子的平均回收率比较

2.3 净化方式的选择

图1 洗脱液体积对比Fig.1 Recoveries comparation of different proportion of eluant volume

选用商品化固相萃取小柱净化是当前药物残留分析的主要净化方式，实验除了使用正己烷进行液液萃取除脂，再结合固液萃取操作，以最大限度的减少待测物中的干扰物。实验比较了相同规格的HLB、C18、MCX和碱性氧化铝小柱的净化回收效果(表1)。结果表明HLB固相萃取柱的萃取效率最高，C18固相萃取柱次之，MCX柱和碱性氧化铝柱最差。同时，为防止固相萃取柱发生过载现象，对比了两种规格150 mg/6 mL和60 mg/3 mL HLB固相萃取柱的吸附能力，结果表明，对于大容量样液150 mg/6 mL HLB固相萃取柱的回收率保持在70%以上，60 mg/3 mL的HLB固相萃取柱的回收率在68%～85%，且60 mg/3 mL HLB固相萃取柱由于柱体小，容易出现柱堵塞情况。因此本方法采用150 mg/6 mL HLB固相萃取柱为净化柱。

2.4 洗脱液体积的确定

为最大限度节省有机试剂使用量同时又能确保目标物的回收率，将5 g空白样品按1.3.1法提取，提取液中加入7种药物混标，过HLB柱，采用不同体积的甲醇进行洗脱回收率实验，结果表明用5 mL甲醇做洗脱液，能将7种药物完全洗脱下来，故确定洗脱液体积为5 mL(图1)。

2.5 检测波长的确定

分别配制一定浓度的7种药物标准溶液，采用紫外检测器做190～540 nm吸收光谱扫描可知，利多卡因、普莫卡因、丁香酚在200 nm附近有最大吸收峰，苯佐卡因、普鲁卡因、丁卡因、布他卡因在290 nm附近有最大吸收峰，为便于归类检测，故确定同时检测200 nm和290 nm的双波长(图2～图4)。

2.6 流动相及其他参数的确定

本方法尝试甲醇/水、乙腈/水、甲醇/0.1%磷酸水、乙腈/0.1%磷酸水、乙腈/0.05%磷酸水溶液作流动相对比，发现纯水作载体峰型过宽且容易有拖尾现象，而加了酸后峰型明显改善，但考虑到0.1%磷酸水的pH值过低，长期使用极易损伤色谱柱而降低其耐用性。因此，选用乙腈：0.05%甲酸水(25∶75)作流动相。

图2 不同项目的全扫描波长图Fig.2 Full scan wavelength graph of 7 anesthetics

图3 利多卡因、普莫卡因、丁香酚标准谱图Fig.3 Standard LC chromatography graph of Lidocaine、pramoxine and eugenol

图4 苯佐卡因、普鲁卡因、丁卡因、布他卡因标准谱图Fig.4 Standard LC chromatography graph of benzocaine、procaine、tetracaine and butacaine

2.7 线性范围与定量限

配制7种麻醉剂质量浓度为0.10，0.20，0.50，0.80，1.0 μg/mL的混合标准工作液曲线来进样测定，以横坐标(x)为进样浓度，纵坐标(y)为峰面积，绘制标准工作曲线，以10倍信噪比作定量限，考察方法灵敏度。所得线性方程、相关系数和定量限见表2。结果表明，在0.10～1.0 μg/mL 7种麻醉剂呈良好线性，决定系数R2均大于0.99，方法定量限为20 μg/kg，完全满足国内外对水产品该类药物的定量分析需要。

图5 不同基质样品的加标对比Fig.5 LC Chromatogram of blank sample and blank sample added with standard solution

化合物Chemical compound线性方程Regression equation决定系数R2定量限LOQ/(μg·kg-1)利多卡因 LidocaineY=1.44e+002X0.999 720普莫卡因 PramoxineY=9.36e+001X0.999 020丁香酚 EugenolY=2.91e+002X0.999 720苯佐卡因 BenzocaineY=1.38e+002X0.999 920普鲁卡因 ProcaineY=5.75e+001X0.998 720丁卡因 TetracaineY=6.22e+001X0.998 820布他卡因 ButacaineY=6.64e+001X0.999 820

由图5的基质空白和按定量限加标对比可知，经过前处理的不同基质样品，检测化合物出峰时间并无杂质峰干扰，基线平稳，峰形良好，响应足够。说明此方法适用于对食用经济鱼类中7类麻醉剂残留的检测。

2.8 回收率、精密度

取空白鱼肉样品分别做0.020，0.040，0.100 mg/kg 3种添加水平，每一水平设6平行，同时设一个空白对照，验证样品的加标回收率和相对标准偏差，结果见表3。

表3 加标回收率和相对标准偏差数据(n=6)

由表3可以看出，7种麻醉剂在3个添加水平范围内，加标回收率在75.2%～98.6%。相对标准偏差RSD在2～10。方法的准确度和精密度良好，均符合残留分析的要求。

3 结 论

本文建立的水产品中7种麻醉剂残留测定的检测方法较国内现有报道的检测方法具有：检测组分种类多且部分项目为首次开展检测研究、利用超高效液相色谱创新性的开展多波长同时检测技术使得方法检出限低、前处理简便、净化效果佳，所用试剂耗材和检测仪器常规实验室均能配备，投入成本低，易于推广实施，能满足筛查和定量需求，为开展水产品中麻醉剂残留安全管理和检测残留提供有效的技术支持。