南瓜谷氨酸脱羧酶酶学特性 及γ-氨基丁酸富集条件

舒成亮,王春茹,郭晓风,单胜艳,薛玉清,欧 凯,李言郡

(杭州娃哈哈集团有限公司,浙江省食品生物工程重点实验室,浙江杭州 310018)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种广泛存在于动植物和微生物体内的非蛋白质氨基酸,作为高等动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质,参与多种代谢活动,具有重要的生理活性。大量研究表明,GABA具有降低血压,治疗癫痫,镇静安神,调节激素分泌,增强记忆,控制哮喘等多种生理功能[1-3]。目前,GABA的制备方法主要有化学合成和生物制备两类方法,前者由于强腐蚀性试剂的使用,反应条件剧烈,得率低等因素难以用于食品加工领域,而生物法包含植物富集法和微生物发酵法,是目前GABA制备的主要方法[4]。微生物发酵法不受资源环境限制,十分契合现代工业集约化生产的需求,但也存在高产菌株难筛选易退化,生产周期长,发酵微生物在食品领域受限的问题。植物富集法简单易行,资源可再生,产物可直接作为食品原料,具备天然优势。鉴于此,植物富集GABA的方法受到国内外学者的广泛关注和深入研究。茶叶[5]、桑叶[6]、谷物胚芽[7-9]、辣椒、茄子等植物是GABA富集研究的主要素材,通过厌氧[9]、浸泡[10]、酶解[8]、低温胁迫[9]、超声波[10]等处理方式,达到富集GABA的目的。但由于GABA在植物体内含量较低,且需要较强的外界刺激,通常GABA富集浓度不高,且工艺复杂,规模化生产可行性不高。南瓜作为价廉易得的大宗农产品,已有研究报道其含有较高GAD活力[11],然而,利用南瓜进行GABA富集在国内外几乎处于空白状态。中国市售食用南瓜从生物学角度划分主要有两类,中国南瓜(Cucurbitamoschata)和日本南瓜(Cucurbitamaxima),针对两类南瓜的GAD活力和GABA富集能力尚未见文献报道。为此,本研究以两类南瓜为原料,通过研究南瓜GAD活性、GABA富集适宜条件及工艺,为探索GABA高效生产方法提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生鲜南瓜 中国南瓜A产自浙江,中国南瓜B产自湖北,日本南瓜C产自浙江,日本南瓜D产自山东;味精 含一水谷氨酸钠99%，市售;磷酸氢二钠、柠檬酸等 均为分析纯;GABA标准品 AN型(P/N G370380)和B型生理体液氨基酸标准溶液(P/N G370381),日本和光试剂公司。

Beckman Coulter Avanti J-26 XP台式高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特公司;全自动氨基酸分析仪L-8900 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南瓜中GAD酶活力测定 将中国南瓜A(下文中未标明南瓜类别均为中国南瓜A)与0.2 mol/L,pH5.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(下文所述缓冲液同上)按1∶1的比例混匀后打浆,制成粗酶液,取10 g粗酶液加入味精0.5 g,加入缓冲液定容至50 mL,充分混匀,40 ℃反应1 h后于95 ℃ 10 min灭酶,10000 r/min,25 ℃离心10 min,取上清液,测定GABA含量并计算GAD活力。GAD活力定义:每分钟催化反应产生1 μmol GABA所需的酶量定义为1个单位活力U。计算公式如下:

式中,c为GABA的质量浓度(g/mL),V为反应液体积(mL),M为GABA的摩尔质量(g/mol),t为反应时间(min),106为mol转化为μmol的系数。

1.2.2 南瓜GAD酶学特性研究 为明确GABA富集过程中最关键的因素-南瓜GAD的特性,同时探明实际生产中南瓜原料的储运和加工条件对南瓜GAD活力的影响,开展以下南瓜GAD酶学特性研究。实验均重复三次,取平均值。

1.2.2.1 南瓜GAD最适反应温度 按1.2.1中所述的方法分别在20、30、35、40、55、70 ℃下测定南瓜GAD活力,确定南瓜GAD最适温度。

1.2.2.2 南瓜GAD最适反应pH 分别配制0.2 mol/L,pH为4.0、4.6、5.0、5.4、5.8、6.4和7.0的缓冲液构建反应体系,按1.2.1中所述的方法测定南瓜浆中GAD在各自pH下的活力,确定最适pH。

1.2.2.3 南瓜GAD的热稳定性 考察不同温度下热处理30 min后南瓜GAD活力的损失情况。以料水比为1∶1制备的南瓜浆作为粗酶液,分别于40、50、60、70、80、90 ℃下水浴保温30 min,保温结束后立即冷却至25 ℃,测定GAD活力及活力损失率。以不经水浴保温的南瓜浆为对照,比较在南瓜GAD活力在热处理后的损失情况。

1.2.2.4 南瓜GAD的冷冻稳定性 考察冷冻数周时间后南瓜GAD酶活力的损失情况。以料水比为1∶1制备的南瓜浆作为粗酶液,将其于零下20 ℃冷冻保存,分别于第0、1、2、3、4、6、8周取出,于25 ℃解冻3 h,25 ℃测定GAD活力并计算GAD活力损失率。以不经冷冻的南瓜浆为对照,考察南瓜GAD经不同时间冷冻后的酶活力稳定性。活力损失率计算公式如下:

式中,A1为未经热处理(或冷冻)的南瓜GAD活力,A2为经热处理(或冷冻)后的南瓜GAD活力。

1.2.3 南瓜预处理及GABA富集 选择外观无损伤无腐败的南瓜,洗净并使用50 mg/L次氯酸钠溶液消毒30 min,纯净水冲洗干净,切成1～3 cm的小块,将无菌水或经灭菌处理的与南瓜按一定比例混合,采用胶体磨打浆3次,确保南瓜被充分破碎。打浆后将味精加入至反应体系中,在合适的温度、pH等条件下静置反应一段时间进行GABA富集,反应结束后,将反应液于10000 r/min,25 ℃离心10 min,收集上清液,测定GABA及L-谷氨酸(L-Glu)含量。

1.2.4 南瓜富集GABA最佳反应条件实验设计 考察反应时间、南瓜品种、反应体系、南瓜添加量、味精添加量、料水比等参数对GABA富集的影响,每个实验方案均重复三次,取平均值。

1.2.4.1 反应时间对南瓜富集GABA的影响 将南瓜与0.2 mol/L,pH5.8的缓冲液按质量比1∶1的比例混匀打浆,制得50%南瓜浆,实验反应体系中南瓜浆40%(w/w),味精1.5%(w/w),30 ℃静置反应,选择0、1、2、4、6、8、18、24 h 8个时间点取样测定GABA及谷氨酸含量。

1.2.4.2 南瓜品种及反应体系对GABA富集的影响 比较中国南瓜A、中国南瓜B、日本南瓜C和日本南瓜D富集GABA能力的差异;同时,为考察缓冲体系在南瓜富集GABA中的实际效果,分别在纯水体系及缓冲液体系中进行GABA富集实验。选取四种南瓜为原料,分别与0.2 mol/L,pH5.8缓冲液和纯水按1∶1的比例混合打浆,反应体系中南瓜浆40%(w/w),味精1.5%(w/w),30 ℃静置反应18 h。比较缓冲液体系与纯水体系下GABA富集量,同时比较四种南瓜在两种体系下的GABA富集能力。

1.2.4.3 南瓜及味精添加量对GABA富集的影响 将南瓜与缓冲液按1∶1打浆后制成南瓜浆,分别按40%,60%和80%(w/w)的比例添加至反应体系中,底物味精添加量分别为1.0%和1.5%(w/w),于30 ℃静置反应18 h,考察南瓜及味精添加量对GABA富集的影响。

1.2.4.4 打浆料水比对南瓜富集GABA的影响 将南瓜与0.2 mol/L,pH5.8的缓冲液分别按1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5及1∶3的比例打浆,添加量均为25%(w/w,以南瓜重量计),味精添加量为1.5%(w/w),温度30 ℃,静置反应18 h,考察打浆料水比对GABA富集的影响。

1.2.5 GABA及L-Glu含量测定 取1.2.1或1.2.3所述上清液,经0.22 μm滤膜过滤,采用氨基酸分析仪进行GABA和L-Glu含量测定。

1.2.6 GABA转化率及GABA富集量计算 GABA转化率定义为GABA实际生成量与理论上谷氨酸钠全部转化为GABA的生成量的比值。GABA富集量定义为单位质量(g)南瓜生成GABA的量(mg)。

1.3 数据分析

采用Excel 2007和SPSS 19.0软件，以Duncan多重比较对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 南瓜GAD酶学特性研究

2.1.1 南瓜GAD最适温度 由图1可知,南瓜GAD在30～35 ℃酶活力最高,在温度20和40 ℃时,GAD活力亦比较高,与最高活力(30 ℃)相比无显著性差异(p>0.05),当温度超过55 ℃时,酶活力有明显的降低(p<0.05)。后续实验选择30 ℃为反应温度。

图1 温度对南瓜GAD活力的影响Fig.1 Effects of temperature on pumpkin GAD activity

2.1.2 南瓜GAD最适pH考察 由图2可知,在所选pH范围内,5.8是南瓜GAD最适pH,在该pH下,酶活力最高,同时,酶活力随pH升高呈先增加后降低的趋势,相比于pH在5.0～6.4时，当pH低于5.0或高于6.4时,酶活力显著降低(p<0.05)。本实验得出的结论与Matsumoto等[11]对南瓜的研究结果一致,Brandon等[12]和吕莹果等[13]分别对豇豆和米胚芽GAD酶学性质进行研究,两种植物GAD的最适pH分别为5.5～6.0和5.6,与南瓜GAD最适pH近似,而刘清等[14]的研究结果表明,乳酸菌GAD最适pH为4.5,与本文结果差别较大。后续实验选择的pH为5.8。

图2 pH对南瓜GAD活力的影响Fig.2 Effects of pH on pumpkin GAD activity

2.1.3 南瓜GAD热稳定性 由图3可知,南瓜GAD活力随保温温度的升高而逐渐下降,损失率逐渐增加,40 ℃保温30 min后南瓜GAD酶活力几乎没有损失,当超过70 ℃进行保温时,南瓜GAD酶活力几乎完全丧失。吕莹果等[13]研究发现米胚GAD的热稳定较差,80 ℃时酶几乎完全失,结果与本实验相符。

图3 热处理对南瓜GAD活力的影响Fig.3 Effects of thermal treatments on pumpkin GAD activity

2.1.4 南瓜GAD冷冻稳定性 由图4可知,冷冻时间在4周以内时,南瓜GAD活力损失率很低(≤10%),冷冻6周以上酶活力损失率逐渐增加,当冷冻时间为8周时,酶活力损失率为36%。

图4 冷冻对南瓜GAD活力的影响Fig.4 Effects of freezing on pumpkin GAD activity

2.2 南瓜富集GABA最佳反应条件的探索

2.2.1 反应时间对南瓜富集GABA的影响 由图5可知,在最初的1 h内,谷氨酸含量急剧下降,同时GABA含量急剧上升,随着时间延长,GABA生成的速率逐渐减缓,反应前4 h生成的GABA含量远高于后20 h,由此可见,在反应前期如何促进GABA含量提高是整个反应的关键环节。经过18 h反应后,反应液中GABA浓度为5267.4 mg/L,换算为单位质量南瓜的GABA富集量为26 mg/g,继续延长反应时间,GABA富集量无显著性增加。与文献中利用玉米胚[7]、米糠[15]、茶叶[5]等作为原料进行GABA富集相比,本研究利用生鲜南瓜可富集更高含量的GABA。后续实验反应时间控制在18 h。

图5 反应时间对GABA浓度的影响Fig.5 Effects of reaction time on GABA concentration

2.2.2 南瓜品种及反应体系对GABA富集的影响 由图6可知,无论在纯水体系还是缓冲液体系下,中国南瓜富集GABA的能力均强于日本南瓜,且产自两个区域的中国南瓜富集GABA能力十分接近,对于日本南瓜亦是如此,可以推断,南瓜的品种对所含GAD酶活力影响比较大,从而影响GABA富集能力。而对于同种南瓜,产地的影响并不大。考虑到后续放大生产中南瓜原料的筛选是核心环节,本实验为南瓜的筛选提供重要参考。后续实验均采用中国南瓜A作为实验原料。

图6 南瓜品种及反应体系对GABA富集的影响Fig.6 Effects of pumpkin varieties and reaction solutions on GABA accumulation

缓冲液体系下进行反应GABA富集量显著高于纯水体系(p<0.05),主要原因在于GABA由谷氨酸分子脱去一个羧基后形成,此过程需要消耗H+,在纯水体系中,随着反应进行,反应液pH会逐渐升高,较高的pH偏离了GAD最佳反应pH,同时带来微生物污染的风险;而在缓冲液体系中,pH的升高得到有效抑制,从而确保反应在合适的环境中继续进行,提高GABA浓度。从更广义的角度说,GABA富集的过程是一个酶反应,包括GAD在内的所有生物酶,在缓冲液中更有利于酶蛋白分子天然构象的保持和活性的发挥。后续实验均选择在缓冲液中开展。

2.2.3 南瓜及味精添加量对GABA富集的影响 由表1结果可知,当味精添加量为1.0%时,不同南瓜浆比例方案GABA浓度、富集量和转化率均有显著性差异(p<0.05),其中南瓜浆比例为40%时,虽GABA富集量较高,但反应液中GABA浓度较低,转化率为90.6%,当南瓜浆比例为60%时,GABA浓度可达5384 mg/L,转化率达到98.7%,由于南瓜浆添加量高,单位质量的南瓜GABA富集量相对减少。当味精添加量为1.5%时,南瓜浆添加比例越高,GABA浓度和转化率越高,添加南瓜浆比例为80%时,GABA浓度可达7647 mg/L,转化率达到93.5%,相比40%和60%具有显著性差异,南瓜浆添加量为40%时,单位质量南瓜GABA富集量最高,但与60%相比并不显著。总之,味精添加量较低时,可选择相对较低的南瓜浆比例,味精添加量较高时,南瓜浆添加比例应适当提高。味精的有效成分谷氨酸钠是GABA前体物质谷氨酸的钠盐,是GAD的底物,对GABA富集量有重大影响,有研究人员进行GABA富集时不额外添加谷氨酸或其钠盐,富集后GABA含量一般仅提高数倍[10],而添加底物则可将GABA含量提高数十倍乃至上百倍[7]。综合考虑,选择南瓜浆40%,味精1.5%作为后续实验条件。

表1 南瓜浆及味精添加量对GABA富集的影响Table 1 Effects of pumpkin syrup and MSG concentration on GABA accumulation

2.2.4 打浆料水比对南瓜富集GABA的影响 由表2结果可知,打浆所用缓冲液比例越高,反应最终获得的GABA浓度越高,相应的,GABA富集量和转化率越高,不同料水比之间,1∶1和1∶3与其他比例之间具有显著性差异,而1∶1.5,1∶2和1∶2.5之间差异不显著。主要原因在于缓冲液比例越高,采用胶体磨打浆时越易将南瓜细胞破碎,促进酶的溶出,进而促进谷氨酸转化为GABA。当料水比为1∶3,且其他参数均选择最佳条件时,GABA富集量达到30.5 mg/g,与未富集时相比(0.23 mg/g)提高了132倍。研究表明,GAD和GABA参与植物应激反应[16],机械压力刺激有助于GABA 的富集，因此本实验中胶体磨提供的机械压力是GABA 富集的动力。此外，本实验室还对底物味精添加顺序进行了初步研究，预先加入至缓冲液中再与南瓜混合打浆比打浆后加入更有利于GABA 富集( 数据未显示) ，验证了底物在应激反应发生后尽快与GAD 接触有助于GABA 富集。

表2 料水比对南瓜富集GABA的影响Table 2 Effects of pumpkin buffer ratio on GABA accumulation

3 结论

对南瓜GAD最适反应温度、最适pH、热稳定性和冷冻稳定性等酶学特性进行研究,南瓜GAD最适反应温度为30～35 ℃,最适pH为5.8;南瓜GAD对热比较敏感,超过50 ℃短时间保温即可导致酶活力快速丧失。冷冻对GAD影响相对较小,但长期冷冻仍会导致酶活力损失。利用南瓜GAD进行GABA富集,探索了反应时间、南瓜品种、缓冲体系、南瓜及味精添加量、料水比对富集效果的影响。选择pH5.8,0.2 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为反应溶液,南瓜与缓冲液的打浆比例为1∶3,南瓜添加量为25%,底物味精添加量为1.5%,30 ℃静置反应18 h,反应液中GABA浓度可达7633.2 mg/L,转化率为93.3%,单位质量南瓜GABA富集量为30.5 mg/g,与未富集时相比提高了132倍。通过减少南瓜或味精添加量可达到提高单位GABA富集量(最高为33.5 mg/g)或转化率(最高为98.7%)的目的,但要以牺牲总GABA浓度为前提,并不是最经济的方案。本研究对南瓜富集GABA的相关工艺条件及南瓜GAD酶学特性进行了初探,为植物富集GABA提供了一条新的路径,然而,该项工作仍面临一些尚未解决的难题,如何确保工业化生产时南瓜内源酶活力的一致性、如何防止反应过程中微生物污染、如何确保GABA浓度的同时减少味精残留、提升口感都需要进一步的深入研究。